亚临床症状猪群中PRRSV和PCV2的感染情况

[目的]了解亚临床症状猪群中PRRSV和PCV2的感染情况。[方法]选择7个有PRRSV和PCV2感染史且有亚临床症状的猪群,通过ELISA和PCR的相结合方法检测其PRRSV和PCV2的感染情况。[结果]ELISA检测结果表明,所有猪场12周龄仔猪PRRSV和PCV2抗体能观察到血清抗体转化。PCR结果表明约3/7的猪场8周龄仔猪PRRSV呈阳性,12和20周龄仔猪PRRSV呈阴性;8~20周龄有不同比例仔猪PCV2呈阳性。[结论]在亚临床症状猪群中PRRSV的感染主要在8~12周龄,而PCV2在8~20周龄都有感染。     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

猪I型补体受体与C3b活性片段相互结合的体外检测

【目的】检测猪红细胞类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)功能域片段的重组质粒建立酵母双杂交检测体系,运用酵母共转化的方法将诱饵质粒（重组pGBKT7-CR1-like）与捕获质粒（重组pGADT7-C3b）共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）严格筛选共转化成功的酵母细胞,再根据报告因子是否表达来鉴别转化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培养板上的生长情况,并结合菌落的颜色变化现象综合判定CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞中是否发生相互结合;然后运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b结合复合物,并对该复合物的特异性进行Western blot鉴定。【结果】试验成功将pGBKT7-CR1-like与pGADT7-C3b基因共转入Y2HGold酵母细胞。共转化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能够正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落呈现蓝色,由此表明,试验中酵母双杂交系统建立成功,并通过试验获得了阳性酵母克隆。共同转化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b质粒的酵母菌落PCR反向鉴定结果显示,在共转化的酵母菌中含有目的基因CR1-like_(3-6)和CR1-like_(8-11),共转化组的质粒酶切后出现C3b基因片段,与设计大小一致,说明重组质粒成功共转化入酵母细胞中。免疫沉淀试验中应用pGBKT7载体的标签抗体c-Myc沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以c-Myc为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以HA单克隆抗体为一抗进行Western blot检测时,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,只有3、4泳道中共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合的复合物。使用CR1-like单克隆抗体沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以CR1-like单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以C3单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,泳道3、4所示只有共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在具有生物活性的CR1-like与C3b识别结合的复合物。通过多个单克隆抗体杂交结果,可看出诱饵质粒的表达产物CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)片段与捕获质粒的表达产物C3b片段可在酵母细胞内发生结合。【结论】猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的识别配体为C3b,为猪红细胞CR1-like功能域分子结构的进一步解析提供了重要数据依据。     

猪萨佩罗病毒间接免疫荧光方法的建立与初步应用

以分离的猪萨佩罗病毒PSV Hu N1/2016株感染PK15细胞,制备抗原板,建立检测猪血清中PSV抗体的间接免疫荧光(IFA)方法。结果表明:一抗最佳稀释浓度为1∶300;FITC标记的羊抗猪荧光二抗最佳稀释浓度为1∶300。该方法特异性强,敏感度高,既能将PSV抗体与PRRSV、FMDV、PCV、CSFV抗体区分开,也可以检测到中和效价0.128的阳性血清。用该方法检测湖南省部分规模化猪场208份临床血清样品的总阳性率为68%,表明PSV在湖南省流行普遍,且其感染主要发生在保育阶段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单抗AG1的生物学特性及夹心ELISA诊断方法的建立

用纯化的猪繁残呼吸综合征病毒沪1株（PRRSV-S1）病毒液作抗原，免疫BALB/C小鼠，获得1株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，命名为AG1。ELISA交叉试验和阻断试验表明，AG1具有高度特异性。AG1可与PRRSV-S1、美洲株VR-2332、欧洲株LV反应，对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价AG1属于IgG2b，腹水效价在1：10^-3-10^-5之间。AG1有100条染色体，琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b。Western bloting试验表明AG1是针对N蛋白抗原表位的特异性单抗。以AG1为捕捉抗原抗体和酶标抗体，建立了快速检测PRRSV抗原的单抗夹心ELISA法，该方法具有快速、灵敏、准确、广谱等特点。     

猪细环病毒1型感染与猪繁殖与呼吸综合征的相关性分析

[目的]分析猪细环病毒1型(TTSuVl)感染与猪繁殖与呼吸综合征(PPRS)的发生是否存在相关性.[方法]采集40头临床疑似PRRS病猪血清和40头同群健康猪血清,确认PRRS病猪与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)亚临床感染猪,用荧光定量PCR方法检测TTSuV1和PRRSV载量,进行差异比较和相关性分析.[结果]常规PCR结合荧光定量PCR检测确认有31头PRRS病猪和27头PPRSV亚临床感染猪,前者PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于后者;虽然PRRS病猪的TTSuV1载量高于PRRSV亚临床感染猪,但其差异不显著.PRRSV感染猪的血清中的TTSuV1载量与PRRSV载量之间无显著(P＞0.05)相关性.[结论]TTSuV1感染与PRRS发生之间可能没有相关性.     

高致病性猪蓝耳病疫苗对猪瘟和蓝耳病抗体水平的影响

[目的]研究高致病性猪蓝耳病(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,HP-PRRS)疫苗对猪瘟(Classical swine fever,CSF)和猪蓝耳病(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)抗体水平的影响。[方法]采用ELISA方法检测3个猪场248份血清的猪瘟(CSF)和猪蓝耳病(PRRS)抗体,并对CSF抗体阻断率和PRRS抗体的S/P值进行多重比较。[结果]猪场A(没有免疫HP-PRRS疫苗)、猪场B和猪场C(都免疫HP-PRRS毒株JXA-1R疫苗)全群猪的CSF抗体阳性率分别为94.29%、53.93%和66.29%,其PRRS抗体阳性率分别为42.86%、91.01%和82.02%。猪场A、C母猪和全群猪的CSF抗体阻断率极显著高于猪场B(P0.01);猪场A的育肥猪和全群猪的CSF抗体阻断率显著高于猪场C。猪场B的母猪、后备母猪、育肥猪、全群猪PRRS抗体S/P值极显著高于猪场A、C(P0.01),猪场C的育肥猪、全群猪PRRS抗体S/P值显著高于猪场A(P0.05)。[结论]免疫HP-PRRS毒株JXA-1R疫苗可能引起猪群CSF抗体水平降低,PRRS抗体水平提高。     

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

【目的】监测2021年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)的分子流行动态,为PRRSV综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同地区PRRSV检测为阳性的37个规模猪场采集521份患病猪组织样本进行PRRSV检测。对样本进行ORF5基因测序,采用DNAStar分析ORF5核苷酸的同源性及其推导氨基酸的同源性,并用Mega7.0构建基于ORF5基因的系统遗传进化树。【结果】从37个猪场采集的样品PRRSV阳性率为24.4%,猪场阳性率为45.9%。通过测序分析获得17株来自不同猪场的PRRSV ORF5基因序列,遗传进化分析表明所有毒株均属于北美毒株（PRRSV 2）,其中有5株属于Lineage 8(JXA1-like和CH-1a-like）谱系,9株属于Lineage 1(NADC30-like和NADC34-like）谱系,3株属于Lineage 3(QYYZ-like)谱系,没有监测到Lineage 5(VR2332-like)谱系的毒株。17株PRRSV毒株的...     

猪繁殖与呼吸综合征·猪瘟和猪圆环病毒Ⅱ型混合感染的鉴定及病原特性分析

[目的]鉴定由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）引发的猪疫病并进行病原特性分析。[方法]采集湖南湘潭（编号为HN/XT）发病猪的组织和脏器,进行DNA、RNA提取,然后进行PCR扩增、测序;同时采用细胞分离技术进行毒株的分离、鉴定。[结果]测序分析结果表明,CSFV、PRRSV和PCV2与目前流行毒序列及GenBank下载序列氨基酸同源性分别为90%、94%和96%左右,可见该次猪病疫情至少是由CSFV、PRRSV和PCV23种病毒混合感染引起。[结论]该研究可对当前危害养猪业混合感染疾病的流行病学研究和净化控制提供数据。     

猪瘟与高致病性蓝耳病混合感染的诊断及病原特性分析

[目的]诊断由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引发的猪疫病,并分析病原。[方法]采集福建某猪场发病猪的组织器官,提取病毒DNA或RNA,PCR检测病毒感染。采用ELISA方法检测CSFV、PRRSV和PRV的感染情况。[结果]测序分析和ELISA结果表明,猪场存在PRRSV、CSFV、PRV3种病毒感染。[结论]该次猪病疫情主要是由CSFV和高致病性PRRSV混合感染引起。     

野猪源与家猪源PRRSV陕西流行毒株对仔猪的致病性试验

【目的】研究野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株对易感仔猪的致病性及发病规律,进一步弄清PRRSV变异株的病原特征及其与"猪高热病"发生的关系。【方法】选取PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原、抗体检测均为阴性的健康仔猪(40日龄)9头,随机分为3组,用家猪源Shaanxi-1及野猪源Shaanxi-2 PRRSV变异株分别感染其中一组仔猪,每头肌注6 mL,滴鼻2 mL;另一组作为阴性对照,按相同剂量和方法接种正常Marc-145细胞处理液。攻毒后各组分圈饲养,每天定时测量体温,绘制体温变化曲线,观察临床症状,记录发病情况。攻毒后采血及咽喉、眼、鼻分泌物和粪便,采用RT-PCR方法检测PRRSV、猪瘟病毒(CSFV)、PCV2、猪伪狂犬病毒(PRV)核酸,用ELISA试验及血清中和试验检测血清抗体。【结果】Shaanxi-1与Shaanxi-2攻毒组均出现体温升高及典型临床症状,但未见死亡病例;攻毒组CSFV、PCV2、PRV核酸检测均为阴性,咽喉、眼、鼻分泌物和粪便在一定时间段可检测到PRRSV核酸;PRRSV特异性抗体检测均为阳性,仅Shaanxi-2攻毒组在第35天检测到中和抗体;Shaanxi-2与Shaanxi-1相比,感染猪的体温较高,临床症状明显,病毒血症的维持时间较长,抗体水平较高。【结论】野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1 PRRSV变异株对易感仔猪具有一定的致病性,能使感染动物发病但不能致死,Shaanxi-2毒株的致病性相对较强。攻毒后第7天出现病毒血症,持续14～21 d后逐渐消退,仔猪感染PRRSV变异株后,病毒可通过鼻、眼、咽喉分泌物及粪便等排出,其中鼻分泌物排毒最早、排毒时间最长,眼、咽喉分泌物与鼻分泌物、粪便相比排毒较晚、持续时间较短。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。     

猪场圆环病毒-2型血清抗体的调查

[目的]监测聊城周边地区猪圆环病毒病的感染和流行情况。[方法]以山东省聊城周边地区的7个养猪场的222份血清为材料,应用ELISA方法配合流行病学调查,检测猪圆环病毒抗体水平。[结果]检测发现7个养猪场的猪群都感染过猪圆环病毒,抗体阳性率在33.3%~83.3%。发病猪群都为5~10周龄的保育仔猪。猪群在断奶后1周左右,出现进行性消瘦,生长迟缓,采食量下降,被毛粗乱,精神差。剖检病变主要表现为发病猪和死亡猪全身淋巴结水肿,发黄,肾脏水肿,肺脏肿大,质地变硬。该疾病初步定为由PCV-2感染所致的猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）。[结论]该研究为制定猪圆环病毒病的综合防制措施奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GXA毒株人工感染仔猪的病理学研究

[目的]探讨PRRSV-GXA毒株对断奶仔猪的致病性。[方法]将12头PRRSV/PCV2抗体和抗原阴性的健康仔猪随机分为感染组（9头）和对照组（3头）,感染组通过口服和肌肉注射方式接种PRRSV-GXA株细胞毒（4ml/头）,对照组接种无病毒的细胞培养液（4ml/头）。感染后第11、14和21天分别剖杀感染组3头和对照组1头,根据临床症状、病理学变化、特异性抗体水平以及病毒核酸等判断其致病性。[结果]仔猪感染PRRSV后第6～10天体温稍微升高,随后逐渐恢复至正常。早期出现短暂的精神沉郁,轻度厌食但没有出现典型临床症状。剖检的病理变化仅见于感染后第21天,有2头感染仔猪肺膈叶前缘出现小的局灶性间质性肺炎,镜检肺泡壁间质增宽,有多量单核细胞和淋巴细胞浸润。在感染后第9天检测到PRRSV特异性抗体,并随着时间呈上升趋势,感染后第21天达到较高值。在4头感染仔猪的肺脏及肺门淋巴结检测到病毒核酸,其中1头仔猪扁桃体也检测到病毒核酸。[结论]PRRSV-GXA毒株对仔猪的毒力较弱,但能刺激机体产生较高水平特异性抗体。     

黑龙江省家畜血清HEV抗体和抗原水平的检测

[目的]探索黑龙江省戊型肝炎病毒（HEV）在家畜中的分布情况。[方法]采用酶联免疫吸附试验法（EusA）,检测来自黑龙江省2个地区血清样品3月龄以上大猪719份、3月龄以下小猪840份、牛505份、羊515份HEV抗原和抗体阳性率。[结果]猪群抗体水平最高,猪群（89．71％）可能比其他种群更容易感染HEV（P〈O．001）。黑龙江省共检测出HEYAg阳性血清样品猪59份,牛3份,羊1份。与吉林、辽宁相比,黑龙江省猪群HEV感染率较高。[结论]黑龙江省猪群感染HEV较为普遍,且大猪感染率高于小猪。     

广西猪戊型肝炎血清流行病学调查

为了解广西各地猪群戊型肝炎（HE）的感染状况及其流行特点,采用双抗原夹心ELISA检测来自广西11个市34个猪场及南宁市某屠宰场猪血清中的抗HEV抗体,并比较分析不同地区、不同年龄段猪抗HEV抗体阳性率的差异。结果表明,所检测的34个猪场均为抗HEV抗体阳性猪场;537份血清中有448份呈阳性,阳性率为83．4％;其中2月龄以内、3-4月龄和5月龄以上猪的抗体阳性率分别为74．0％、47．0％和95．5％,差异显著（P〈0．05）;广西各地区猪群抗HEV抗体阳性率均在70．0％以上,差异不显著（P〉0．05）。可见,广西猪群普遍存在HEV感染,且母源抗体消失后,猪群抗HEV抗体阳性率随着年龄增长而升高。     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性SIgA抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化，采用纯化的病毒作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体，通过优化检测条件，建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒SIgA抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔^-1，样本最佳稀释比例为1∶5，作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100，作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV SIgA抗体，与PoRV(Porcine rotavirus, PoRV)、 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应；批内、批间重复试验的变异系数小于10%，具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发...     

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。     

猪病毒病抗体及病原的检测及分析

[目的]研究猪场猪病毒病的抗体水平及感染情况,为猪病的防制提供理论依据。[方法]抽样采集各类猪只血液和组织样品,分别应用酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）及反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对猪瘟（CSF）、猪伪狂犬病（PR）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）及猪圆环病毒病（PCV-2）的抗体、病原进行检测分析。[结果]结果表明,猪场存在CSF、PR野毒感染;PRRS免疫抗体水平不太理想,阳性感染率为3.3%～17.3%;PCV-2阳性感染率为0～9.6%。[结论]试验猪场病毒病,应采取完善的综合措施才能获得理想的效果。