羽衣甘蓝Exo70A1基因的分离及表达分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S13-b S13-b）为试材,从柱头中分离Exo70A1基因,命名为BoExo70A1,GenBank登录号为JF919716。BoExo70A1全长cDNA序列为2 184 bp,包含56 bp的5′非编码区,211 bp的3′非编码区和一个长度为1 917 bp的开放读码框（ORF）,对应编码一个含有638个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对分析表明,羽衣甘蓝BoExo70A1与油菜BnExo70A1、拟南芥AtExo70A1的一致性分别为99%和94%;BoExo70A1基因结构含12个外显子和11个内含子,内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU-AG规则;Southern杂交结果显示,BoExo70A1在羽衣甘蓝基因组中存在多拷贝;Northern杂交结果显示BoExo70A1在茎、叶、花瓣、花药、柱头、花柱和子房中表达,而且在叶中的表达量最低。     

牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

野蔷薇（Rosa multiflora）抗白粉病基因RmMlo的克隆与表达分析

以野蔷薇（Rosa multiflora）为试材,采用RT-PCR和RACE方法从叶片中获得了一个Mlo同源基因的cDNA全长,命名为RmMlo,GenBank登录号为JF310747。序列分析结果表明,RmMlo基因cDNA全长为1993bp,包含49bp的5′非编码区、243bp的3′非编码区和一个长度为1700b...     

马铃薯C-8,7甾醇异构酶基因(StSI1) cDNA克隆及表达

 以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。     

唐菖蒲质膜水孔蛋白基因GhPIP1;1 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus‘Eerde’）花瓣中克隆得到1个质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）类的水孔蛋白基因,命名为GhPIP1;1。该基因cDNA 全长1 130 bp,包含867 bp完整开放阅读框（ORF）,编码288个氨基酸。克隆和分析相应的gDNA序列（2 098 bp）表明,其包含由4个外显子和3个内含子组成的编码区序列。氨基酸序列分析表明GhPIP1;1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala）基序。同源性分析显示GhPIP1;1氨基酸序列与同科的荷兰鸢尾（Iris hollandica）PIP1氨基酸序列的同源性达94%。半定量RT-PCR分析表明,GhPIP1;1在唐菖蒲花瓣、雄蕊、雌蕊、茎、苞片和叶片等均有表达,但表达量以花瓣中最高,叶片中最低;GhPIP1;1在花蕾至花朵盛开期间的表达水平较高且变化不明显,但在花朵盛开后的萎蔫过程中表达水平明显降低。     

马铃薯GLDH基因的克隆及序列分析

 以马铃薯品种‘Favorita’叶片中的cDNA为模板,采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了L–半乳糖酸–1,4–内酯脱氢酶（EC 1131213,GLDH）基因cDNA 2 563 bp的全长序列,命名为StGLDH（GenBank：FJ755844）。序列分析表明,该基因编码区长1 773 bp,编码590个氨基酸,与其他植物GLDH氨基酸序列具有很高的同源性,尤其与番茄、辣椒、烟草GLDH 氨基酸序列具有90.6% ~ 95.9%的同源性。荧光定量分析表明,该基因在马铃薯不同器官中均有表达,在幼叶和功能叶中表达量最高,在茎中表达量最低;除匍匐茎外,其它器官中抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）含量与StGLDH的表达高度一致。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

观赏向日葵花青素苷合成途径同源基因的克隆与表达

 根据已发布基因的保守区域设计引物,从观赏向日葵（Helianthus annuus L.）舌状花中克隆到花青素苷生物合成途径中PAL、CHS、CHI、F3'H、DFR和ANS等6个结构基因的保守序列。序列分析表明6个结构基因与其它植物来源的花青素苷生物合成相关基因均具有较高的同源性,分别为95%～97%、83%～99%、64%～80%、80%～82%、64%～85%和87%～89%。系统进化分析表明6个结构基因的系统进化基本上符合植物分类学分类。半定量RT-PCR分析,表明除CHS基因在管状花中未表达外,6个基因在舌状花、管状花、花蕾、叶片、茎皮中均有表达;大部分基因在花开放初期和盛期的表达较高,而花完全开放后,所有基因的表达量降低;观赏向日葵花青素苷合成相关基因的表达量在紫红色花瓣中高于红褐色,深色花瓣高于混杂色花瓣。     

桃果实PpOAT 和PpP5CS 的克隆及其对外源#br# GABA 处理的响应表达

 利用RT-PCR 结合RACE 技术从‘玉露’桃果实中克隆得到Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶 （P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）基因的全长cDNA 序列,分别命名为PpP5CS 和PpOAT（GenBank 登 录号分别为KP973954 和KP973956）。PpP5CS 全长2 511 bp,开放阅读框为2 151 bp,编码717 个氨基酸 组成的蛋白质多肽,5′-UTR 长度为123 bp,3′-UTR 序列长度为235 bp;PpOAT 全长1 686 bp,开放阅读 框1 416 bp,编码472 个氨基酸,5′-UTR 长度为151 bp,3′-UTR 序列长度为119 bp。进化树分析发现, PpOAT 和PpP5CS 与湖北海棠的同源性最高,与MhOAT 和MhP5CS 的相似性分别达到88%和91%。采 用荧光定量PCR 分析了外源5 mmol · L-1 GABA 处理对桃果实0 ℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸 合成关键基因PpOAT 和PpP5CS 表达的影响。结果表明,GABA 处理能显著抑制‘玉露’桃果实0 ℃贮 藏期间果肉出汁率的下降,减轻冷害。通过上调果实中PpOAT 和PpP5CS 的表达,提高内源脯氨酸的合 成和积累,进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力,可能是外源GABA 处理减轻桃果实冷害的重要原因。     

狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析

利用RACE 技术从狗蔷薇（Rosa canina）类根体中克隆得到1 个细胞分裂素氧化酶基因cDNA全长,命名为RcCKX5。序列分析表明,RcCKX5 cDNA 全长1 815 bp,5′ UTR 104 bp,ORF 1 626 bp,3′ UTR85 bp,编码541 个氨基酸,具有CKX 家族典型的FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和CK（细胞分裂素）结合域。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示RcCKX5 与可可TcCKX5 亲缘关系最近,与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5 同源性较高。荧光定量PCR 分析表明,狗蔷薇RcCKX5 在其根、茎、叶、花、果实中均有表达,根中相对表达量最高,花和果实中相对表达量较高。在狗蔷薇类根体形成发育过程中RcCKX5 的相对表达量不断升高,21 d 时达到最高,随后稍有下降,表明其可能参与了类根体的形成。6-BA 处理结果表明RcCKX5 能够快速响应6-BA 的诱导,表达量显著上调,2.5 mg · L-1 6-BA处理120 h 时,RcCKX5 的相对表达量达到最高峰。     

杨梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果实中的表达分析

以‘荸荠’和‘东魁’杨梅果实为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到果糖激酶基因MrF RK2的全长c DNA序列。MrF RK2全长1 279 bp,ORF阅读框全长996 bp,3′端非编码区227bp,5′端非编码区56 bp,编码332个氨基酸残基。通过氨基酸序列分析发现Mr FRK2含有pfk B碳水化合物磷酸果糖激酶家族高度保守的1个ATP结合域和2个底物结合域;Mr FRK2与杨树Pt FRK2相似性最高,达到85%。利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达的结果表明,Mr FRK2在‘东魁’杨梅果实的发育早期大量表达,在成熟后期表达量下降,果实成熟初期Mr FPK2表达量‘东魁’显著高于‘荸荠’。果实成熟期间果糖含量‘东魁’显著高于‘荸荠’,与果实成熟期间Mr FPK2的表达量相反。这表明,MrF PK2在杨梅果实成熟期间果糖降解过程中可能起一定作用。     

番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

 以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长cDNA序列为信息探针, 筛选NCBI番茄EST数据库, 依据同源EST信息,经人工拼接、RT-PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SlSAMDC1(GenBank登录号：EF550528),并利用染色体步移技术克隆了879 bp的上游调控区域。SlSAMDC1 cDNA序列全长1 847 bp, 5′-UTR和3′-UTR分别长523 bp、241 bp;存在3个ORF(微型uORF、小型uORF和主ORF),主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SlSAMDC1基因组序列全长3 648 bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。SlSAMDC1基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SlSAMDC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SlSMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W-box、TATA-box、CAAT-box等。     

甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好及功能预测分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基因片段,通过RACE技术克隆基因全长序列;该基因ORF长度2718 bp,编码905个氨基酸,分子量大小为102kD（ExPaSy的分子量分析）,等电点为6.12,含有147bp的5＇UTR和382 bp的3＇UTR,Genbank上的注册号为EU163265,甜菜硝酸还原酶基因编码多肽含有3个氧化还原功能区：钼辅因子功能区（eukary NR Moco;93-478）,Fe-血红素结合区（Cyt-b5;535-608）,FAD结合区（FAD binding 6;653-760）。利用网上的公共数据库和相关软件对该基因氨基酸偏好和编码蛋白的理化性质进行了分析,并对其功能进行了预测。上述研究结果为下一步基因的表达与调控研究奠定了基础。     

番荔枝开花调控转录因子基因AsLEAFY的克隆与表达分析

利用同源克隆和RACE-PCR获得番荔枝LEAFY基因的全长cDNA序列,命名为AsLEAFY,Gen Bank登录号为KP866145。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsLEAFY基因长为1 236 bp,编码411个氨基酸,该氨基酸序列含有5′-N端脯氨酸富集区和中央酸性区,具有LEAFY(FLO)家族的典型结构特征。同源分析表明,该氨基酸序列与多种木本植物LEAFY类蛋白的同源性较高。进化树分析表明AsLEAFY与木本植物的亲缘关系高于草本植物。实时定量PCR结果表明,AsLEAFY在番荔枝花发育的整个过程中都有表达,在初期的花芽中表达量最高,在不同组织器官中表达量存在差异,在枝条去叶后的腋芽中的表达量最高。推测该基因在番荔枝花器官形成初期发挥重要作用。