水稻白叶枯病菌Zur和HrpG平行调控hrcC基因表达

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。     

水稻白叶枯病菌Zur和HrpG平行调控hrcC基因表达

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。     

水稻白叶枯病菌hrpG调控基因的鉴定

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是水稻上最严重的细菌病害之一。Xoo与寄主水稻的互作依赖由hrp基因编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS),将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注射入水稻细胞,引起BLB症状的扩展。HrpG是hrp基因转录表达的主要调控因子。为了鉴定未知的hrpG调控子,本研究在以hrpG∷gusA为报道基因构建的转座子突变体库中,筛选获得4个候选的hrpG负调控子突变体G24-46、G48-22、G19-14和G57-41。GUS活性测定、荧光定量PCR以及烟草组织的GUS染色试验均显示,在这些突变体中hrpG的表达显著增加。Southern杂交结果显示,突变体中转座子均为单一位点的插入。插入位点分析结果显示,在G24-46、G48-22、G57-41和G19-14中转座子分别插入在minD、pilA、metB和wxoB基因中。毒性测定结果显示,这4个突变体在水稻上的毒性显著降低。这些hrpG调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌hrpG上游调控网络提供了新的科学线索。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

含hrp基因的克隆片段在水稻白叶枯病菌不同小种中的功能和同源性

 将从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye,简称Xco)小种3菌株JXOⅢ中克隆的hrp基因片段(pNAX3103),用三亲交配法向病菌其它小种及其毒性基因突变体转移,结果表明pNAX3103可以进入其它小种,但对不同小种毒性基因突变体的转移能力则不同。功能互补分析表明;该hrp基因片段在不同小种中对病菌的生长,以及蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的产生和分泌无明显影响;在野生型菌株中能增加亲本菌株对水稻品种IR26的致病力(JXO I)或亲和性(JXO V),对于毒性基因突变体,pNAX3103虽能进入JXO I经Tn5诱变的毒性基因突变体XcoM1107,但不能恢复其致病性和淀粉酶阴性反应。用hrp基因片段作为探针,对10个来源不同的小种或菌系群进行DNA同源性分析,结果与所有Xco菌株都有明显的同源性杂交带,但杂交带型不同,与甘蓝黑腐病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌、大白菜。软腐病菌的DNA有同源杂交带,但与水稻基腐病菌DNA无同源性。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

水稻条斑病菌rsmA基因在致病性中的功能分析

RsmA属于CrsA/RsmA蛋白家族成员,是一类RNA结合蛋白,作为一类全局性的转录后调控因子,调控碳代谢、生物膜形成、游动性以及致病性相关基因的表达等。同源性搜索结果显示,水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105中存在rsmA基因,其与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的rsmAXoo同源性为100%。但是,r smAXoc基因在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的rsmA缺失突变体RΔrsmA。寄主水稻和非寄主烟草接种结果显示,RΔrsmA在水稻上仍具有致病性,在非寄主烟草上也能够激发HR反应,这些结果与已鉴定的Xoo rsmA突变体表型不一致。但是,与野生型菌株相比,RΔrsmA在感病水稻上的毒性显著降低;在丰富和贫乏的培养基中,RΔrsmA的生长能力也明显减弱。其他毒性相关表型的测定结果显示,与野生型菌株相比,RΔrsmA在半固体培养基上的游动能力减弱,生物膜形成能力增强,胞外多糖产量明显降低,胞外蛋白酶的活性增加。这些结果暗示在Xoc中rsmA为重要的毒性相关基因,在Xoo和Xoc中RsmA在致病性中的功能存在一定的差异,RsmA下游调控基因的鉴定可能为解析其在2个水稻致病变种中功能的差异提供线索。     

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。     

水稻条斑病菌hrpD5基因在致病性中的功能分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)成功侵染水稻主要依靠其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)分泌的效应蛋白。T3SS由hrp-hrc-hpa基因编码,其中主要的hrp和hrc基因突变,病原菌将丧失在寄主水稻上的致病性和非寄主烟草上的过敏性反应(hypersensitive response,HR)。hrpD5基因位于hrp基因簇hrpD操纵单元的第5个基因,在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的hrpD5缺失突变体RΔhrpD5。植物接种试验显示,RΔhrpD5丧失了对寄主水稻的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力;功能互补子虽然能够恢复这2种表型,但是,与野生型菌株相比,其在感病水稻上的毒性显著降低,在非寄主烟草上形成延迟的HR反应;荧光定量PCR结果显示:hrpD5缺失影响其下游hrpD操纵单元基因hrpD6、hrpE和hpaB以及HrpX操纵单元基因hrpF和hrpB1的表达;同时,hrpD5缺失降低了hrpX的mRNA水平,但是不影响hrpX的启动子活性;酵母双杂交结果显示,HrpD5蛋白能够与HrpF蛋白的N端互作。这些结果暗示在Xoc中hrpD5不仅为主要的致病相关基因,而且调控主要的hrp调节基因hrpX的表达。HrpD5新功能的鉴定将为解析T3SS在致病性中的功能提供线索。     

水稻白叶枯病菌的血清学研究

 用戊二醛固定的5个水稻白叶枯菌株制备了5个抗血清,利用琼脂双扩散、试管凝集、免疫电泳和酶联免疫吸附试验研究了107个水稻白叶枯菌株血清学反应的差异,将它们分为三个血清型。属于Ⅰ型的菌株(OS-225、F₄等)占供试菌株的95%,分布于全国各稻区;归属于Ⅱ型的菌株(OS 209、OS-109等)占5.6%,主要来自南方边远地区;Ⅱ型仅1个菌株(G₈),占0.9%,来自广西东部;其中还有两个菌株和上述抗血清均不能反应,暂不能归型,来自福建。血清型和致病型之间的相关性不用戊二醛固定、热处理等5种不同方法处理菌体后制备的抗血清之间,表现出一致的反应特异性和相似的"型"专化性。免疫电泳结果表明,不同血清型的免疫源组成是不同的,Ⅰ型仅具中性免疫源,Ⅱ型具中性及偏碱性免疫源,而Ⅱ型则具中性及偏酸性两种免疫源。
比较了反向间接血凝、酶联免疫吸附和免疫荧光反应等方法检测病菌的灵敏度,以免疫荧光试验(IF)为最灵敏,可检测到每毫升10³细胞,ELISA其次(10^4-5cell/ml),反向间接血凝法为10^6-7cells/ml,双扩散法最差,只有在高达10⁸ cells/ml时才有阳性反应。     

水稻条斑病细菌hrp调节基因hrpGXooc和hrpXooc的克隆和序列分析

 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola基因文库的hrp基因克隆pUHRS138携39.3-kb大小的hrp基因片段。经系列亚克隆和对hrp^-突变体的功能互补验证,4.5-kb BamHI-KpnI为最小功能片段,该片段可使X. o. pv. oryzicola的hrp^-突变体恢复在烟草上激发产生HR和在水稻上具致病性。序列测定和分析显示,4.5-kb hrp片段中含hrpXooc和hrpG_Xooc基因。单独的hrpG_Xooc和hrpXooc不能功能互补hrp^-突变体。hrpXooc与其它黄单胞菌中已克隆的hrpX的同一性达83%以上,推测的蛋白质水平上的差别主要在32、141、164、175、213、247和357位点上。HrpX序列中α-螺旋-转-α-螺旋结构在黄单胞菌中高度保守。hrpG_Xooc与水稻白叶枯病菌的hrpGXoo同一性达96%,与X. campestris pv. vesicatoria的hrpG_Xcv同一性达87%,与Ralstonia solanacearum的hrpG_Rs同源性较低,4种HrpG蛋白质水平上的差别主要集中在22、29、115和252位点上。HrpGXooc和HrpGXcv同列比较显示,3~9和216~220区域的氨基酸序列有所不同,可能反映了HrpG蛋白在感知环境信号和调节hrp基因表达方面的差别。     

利用多重PCR诊断水稻白叶枯病和细菌性条斑病的复合发生

为准确检测水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌及这两种病菌的复合发生,利用软件DNAStar分析比较这两种菌的部分核酸序列,设计了检测这两种病菌的特异性引物。引物Xoo F-Xoo R能特异性扩增出水稻白叶枯病菌中一条大小162 bp的条带;引物Xooc F1-Xooc R1和Xooc F2-Xooc R2能够分别特异性扩增出水稻细菌性条斑病菌中690 bp和945 bp的条带。通过优化PCR反应条件,成功建立了多重PCR技术,可以对不同国家的水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌进行准确检测,对由这两种病菌引起的复合侵染实现了准确诊断。     

Melatonin treatments reduce the pathogenicity and inhibit the growth of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola

Rice bacterial leaf streak (BLS), caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xoc), is a prevalent disease worldwide. Melatonin, an indoleamine with the chemical name N-acetyl-5-methoxytryptamine, is known to inhibit the growth of human pathogenic bacteria. However, the impact of melatonin on agricultural pathogenic bacteria remains poorly understood. In this study, the effect of melatonin on Xoc was investigated. Exogenous melatonin (200 μg mL⁻¹) significantly inhibited the growth of Xoc and reduced the mRNA expression level of seven cell division-related genes. Melatonin reduced the pathogenicity of Xoc towards the susceptible rice IR24. The lesion length in IR24 infected by Xoc pretreated with melatonin (200 μg mL⁻¹) was more than 23% smaller than the lesion length of the control group. Similarly, infection of IR24 leaves by Xoc pretreated with melatonin (200 μg mL⁻¹) reduced the bacterial population by 45%. The biofilm formation, swimming motility and extracellular protease activities of Xoc also decreased under melatonin treatment. Melatonin only slightly changed the morphology of Xoc but significantly reduced the mRNA expression of toxin genes. Furthermore, treating leaves with exogenous melatonin reduced the incidence of BLS by 17%. It is reported for the first time that melatonin reduces pathogenicity and may serve as a bactericide for controlling BLS disease.     

利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌

 设计水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,并建立相应的PCR检测体系,分别对31株水稻细菌性条斑病菌和15株水稻白叶枯病菌及其它相关菌株进行了测试。结果表明,建立的PCR检测体系可专化性检测水稻细菌性条斑病菌,而水稻白叶枯病菌和其它菌株均没有扩增信号。检测灵敏度可以达到20个细菌菌体,从自然发病和人工接种发病的水稻种子成功地检测出条斑病菌。实现了对水稻细菌性条斑病菌的快速和专化性检测。     

水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究

从江苏省南京、泰州、扬州和宿迁等地区水稻田采集水稻病叶、健叶、根围土等样品90份,分离纯化得到1173个细菌分离物,对其进行水稻细菌性条斑病菌Xanthomonasoryzaepv．oryzicola皿内抑制试验,共获得12株拮抗能力较强的细菌,其中4株拮抗细菌抑菌圈直径大于27mm。盆栽试验结果表明,12株拮抗能力较强的细菌中有4株对水稻细菌性条斑病菌防效大于50％,其中菌株Lx-1l盆栽防效达62．5％。大面积示范试验结果表明菌株Lx．11田间防效达60．2％,显著高于化学药剂20％叶枯唑的防效（51．2％和45．8％）。形态特征、理化特性和分子鉴定分析确定菌株Lx．11为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens。     

水稻条斑病菌异柠檬酸脱氢酶在致病性中的功能分析

 异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IcdH)催化异柠檬酸转化成α-酮戊二酸,参与碳代谢途径末端的三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环。然而,编码异柠檬酸脱氢酶基因是否参与水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)的致病性,我们并不清楚。为了阐明IcdH的作用,通过同源重组技术获得了Xoc的icdH基因缺失突变体(RΔicdH),并对该突变体进行了相关功能研究。研究表明:该突变体不能利用苹果酸、丙酮酸和柠檬酸,在寄主水稻上的生长能力和致病力相对于野生型均显著降低,其游动性也显著减弱; 功能互补子恢复RΔicdH的上述表型至野生型水平; Real-time PCR结果显示,六碳单糖、蔗糖、苹果酸、丙酮酸与柠檬酸能显著诱导icdH基因的转录表达;与水稻细胞互作时icdH基因受诱导表达,并受HrpX和HrpG负调控。这些结果说明:icdH基因是Xoc获取碳源和在寄主水稻上具有致病性所需的。     

水稻条斑病细菌类Harpin蛋白的纯化与特性研究

 用硫酸铵沉淀、制备等电聚焦电泳、阴离子交换层析等方法从水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xooc) RS105菌株突变体M51菌体破碎液中纯化出可激发烟草产生过敏性反应(hypersensitive response,HR)的蛋白类物质,分子量约为25.5 kDa。该物质与梨火疫病菌(Erwinia amylovora))的HarpinEa和水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)的Harpin_Xoo具有相似的生物活性和理化特性:可激发烟草产生典型的HR反应;对热稳定,对蛋白酶K敏感;RNA转录抑制剂放线菌素D、蛋白质合成抑制剂环己酰亚铵和钙离子通道阻断剂氯化镧能够抑制该物质激发烟草产生HR;该物质具有诱导烟草抗TMV的功能。据此,将该物质命名为类Harpin蛋白(Harpin-like protein,HLP_Xooc)。     

辣椒疮痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)和水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)的质粒及其与耐链霉素和耐铜性关系

 从不同省份收集到辣椒疮痂病菌Xanthomonas vesicatoria (XV)7个菌株和水稻细菌性条斑病菌X. oryzae pv. oryzicola (XOZ)14个菌株,进行了质粒微量制备。XV菌株除XV1外都检测到质粒,单个菌株拥有的质粒数为2~5个,大小在10~100kb,没有发现为所有菌株所共有的质粒,但XV2、XV3、XV4、XV5、XV6共享1个大约55 kb的质粒。14个XOZ菌株都含有1个质粒,除XOZ5外,其余的13个菌株都含1个约40 kb的质粒。所有菌株都不耐铜。XOZ菌株仅XOZ7对链霉素表现耐性,4个XV菌株即XV4、XV5、XV6和XV7耐链霉素。用XV质粒转化无质粒菌株,发现XV5的1个76 Kb质粒与耐链霉素有关。     

水稻细菌性条斑病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I荧光染料为指示剂,针对水稻细菌性条斑病菌糖基转移酶,设计了4条普通LAMP引物,并在此基础上设计了2条LAMP环引物,建立了水稻细菌性条斑病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。结果表明:水稻细菌性条斑病菌呈荧光的阳性反应,近缘菌株则呈橙色的阴性反应;检测灵敏度DNA为100 fg/μL,菌悬液为3×103 cfu/m L。LAMP技术的建立为现场检疫和大规模检测提供了新的方法。