香梨树腐烂病菌表型菌株生物学特性及致病性

<正>0 引言库尔勒香梨是新疆的特色梨种,近年来由于腐烂病的发生,造成巨大的经济损失[1],已成为制约农民增产增收的主要因素。梨树腐烂病菌因产孢体和孢子的形态受环境影响大,故形态鉴定准确性较差,导致国内外病原菌学名使用混乱[2-6]。本试验从库尔勒香梨主产区采集分离得到303株腐烂病菌菌株,选取菌落表型存在明显差异的8株作为研究对象,明确其种类,测定其生物学特性和致病性分化,为揭示香梨树腐烂病菌遗传多样性提供参考,     

苹果和梨球壳孢腐烂病

2001年11月至2002年1月，美籍学者C．L.Xiao博士在美国华盛顿州的冬梨（品种：d’Anjou，属西洋梨）上发现一种不明真菌造成的储藏期果实腐烂，病梨来自14个果园，烂果率2％-8％，平均4％；2002年3月至5月，又从储藏的19个果园的病梨中分离到这种真菌，烂果率2％-21％，平均6％。经病原形态鉴定和致病性测定，将引起这种果实储藏期腐烂的真菌确定为球壳孢属一新种Sphaeropsis pyriputrescens Xiao ＆ J．D．Rogers。2003年3月至7月间，作者又在华盛顿州的储藏期苹果上发现该病害，发病品种为Golden Delicious,Granny Smith和Red Delicious，其中在RedDelicious上造成的损失高达24％。C．L．Xiao提议将此新病害称为“苹果和梨球壳孢腐烂病”（Sphaeropsis rot of appple and pear）。     

苹果腐烂病菌分生孢子田间消失规律研究

 苹果腐烂病(Valsa mali Miyaba et Yamada)为苹果树重要病害之一。病菌分生孢子器的形成规律及分生孢子在田间消长传播规律为病菌整个侵染循环中一重要环节。     

虎杖提取物对苹果腐烂病菌的抑菌机制

本文采用乙醇热回流法提取虎杖,以苹果腐烂病菌为指示菌,利用固体培养方法研究虎杖乙醇提取物对病菌的抑制率,通过液体培养方法研究其对菌丝形态、菌丝干重等的影响,同时探究其对菌丝体内几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性、蛋白酶活性、可溶性蛋白含量及还原糖含量等一些生理生化指标的影响。结果表明,虎杖乙醇提取物对苹果腐烂病菌有明显的抑制作用。当虎杖提取物浓度达800 mg/L时,对菌丝干重的抑制率高达96.5%;抑制蛋白、葡萄糖等菌体细胞内物质的合成,其含量最高可降低为对照的45.2%和23.0%,从而使病菌代谢速度减慢,抑制其生长;使2种细胞壁相关水解酶,几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶的活性分别升高3.36和7.98倍,降解细胞壁,破坏菌体结构,使菌体自溶。     

香蕉枯萎病菌的培养性状和致病性研究

2001～2004年对采自海南省各市县香蕉种植区发病的1 8个香蕉和粉蕉假茎枯萎病菌分离物进行了培养性状及致病性研究。结果表明,海南省香蕉和粉蕉假茎枯萎病菌的分离物不仅在培养特性上存在明显区别,且在致病性上也存在强、弱2种不同类型:即致病性极强的4号生理小种和致病性相对较弱的1号生理小种。     

用离体巴梨枝条测定梨火疫病菌的致病性

梨火疫病Erwinia amylovora是蔷薇科仁果类果树上一个毁灭性的细菌病害,主要危害花、叶和嫩梢,同时也发生在果实、枝条和树干上。病原菌寄主范围十分广泛,多达140多种植物。此病可通过果实、接穗、苗木、风雨、昆虫甚至远距离     

苹果黑星病菌中国菌株生物学特性研究

 苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke) Wint.)适合生长的培养基有苹果叶汁、苹果果汁、麦芽浸渍物、PSA、PDA、V8和马铃薯麦芽糖;适合产孢的培养基有苹果叶汁、V8和PSA。菌落生长和产孢适宜的pH值为5.0~6.5,温度为15~20℃。在碳源和氮源中,蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、酵母提取物、硝酸钠和牛肉膏有利于病菌生长和产孢,硫酸铵抑制产孢,草酸铵抑制菌落的生长和产孢。20℃时,光周期为12 h,光照强度为600 lx条件下有利于病菌在PSA培养基上生长和产孢,其产孢量约为黑暗条件下的13倍。病菌分生孢子在水滴中萌发的适宜温度为20~25℃,最适pH值为5.0~6.5     

应引起检疫重视的苹果和梨球壳孢腐烂病

2004年肖长林(C.L.Xiao)报道了华盛顿州苹果和梨上发生的一种病原菌Sphaeropsispyriputres-cens,该病原菌主要引起储藏期苹果和梨的果实腐烂。本文对该病的发现、危害和症状以及病原菌形态、生物学特性、分离和鉴定方法等几个方面进行了综合概述,旨在为我国的进口美国水果检验检疫工作提供理论参考。     

S-921菌株发酵液对泡桐腐烂病菌作用的研究

室内实验结果表明,金色链霉菌S-921菌株对泡桐腐烂病菌具有很强的抗生作用,将两者于PDA平板培养基上共同培养8天,出现直径3cm的抑菌圈。经S-921菌株发酵液浸泡处理的泡桐腐烂病病原菌菌丝体,会出现大量液泡,原生质凝集,菌丝尖膨大等异常形态,并失去致病力。S-921菌株发酵液(原液)对泡桐腐烂病的治疗效果,以刮除病班后涂抹发酵液的效果最佳,治愈率达100％。     

亚洲梨黑星病菌致病性及其寄主抗病机制的研究进展

梨黑星病是亚洲梨的主要病害之一。该病是由纳雪黑星病菌(Venturia nashicola)感染所致。V.nashicola主要寄生在亚洲梨叶片表皮细胞壁的果胶质层中。该菌的感染可能主要与分泌的细胞外分泌物质、角质分解酶、过氧化氢和果胶质分解酶有关。而亚洲梨对V.nashicola的抗性可能主要与多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白、多种病程相关蛋白、富亮氨酸重复类受体蛋白激酶等有关。另外,不具直接杀菌能力的系统抗性诱导剂acibenzolar-S-methyl(ASM)在大田试验中对梨黑星病菌有较好控制效果。这与ASM诱导的植物防御反应,包括多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白和几丁质酶等有关。     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子,调控多种DNA代谢,在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚,为此,本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4,利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式,利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除,然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析,并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调,接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏,在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%,VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%;综上所述,Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

苹果树腐烂病菌拮抗放线菌JPD-1的筛选及鉴定

为筛选对苹果树腐烂病菌Valsa mali具有拮抗作用的放线菌,从苹果树根际土壤中分离获得放线菌,利用平板对峙法和生长速率法筛选拮抗活性较高的菌株,通过菌株培养特征、形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析确定其分类地位,并采用离体枝条烫伤接种法测定所筛选获得的拮抗菌株对苹果树腐烂病的防效。结果表明,从苹果树根际土壤中共分离获得28株放线菌,其中菌株JPD-1对苹果树腐烂病菌的拮抗作用最强,抑制率为72.50%,该菌在高氏合成1号培养基上生长最好,培养7 d时菌落生长旺盛,气生菌丝白色,基生菌丝深粉红色,无可溶性色素产生;经形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,将菌株JPD-1鉴定为公牛链霉菌Streptomyces tau‐ricus。菌株JPD-1发酵滤液对苹果树腐烂病菌的抑制率及对离体枝条上苹果树腐烂病的防效均随稀释倍数的增大而减弱,发酵滤液原液使苹果树腐烂病菌菌丝膨大、末端畸形,抑制率为78.14%,对离体枝条上苹果树腐烂病的防效为76.37%。表明分离到的放线菌菌株JPD-1可以用作苹果树腐烂病的生防材料,具有很好的开发及应用前景。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

温度对梨树腐烂病菌生长、病斑扩展及产毒素水平的影响

为探明温度对梨树腐烂病菌生长、病斑扩展及产毒素水平的影响,采用常规生物学方法和高效液相色谱法,测定了该病菌强致病力菌株LXS240101在不同温度下的菌丝生长、病斑扩展及产毒素水平。结果表明:菌株LXS240101最适宜的生长温度为25~30℃;在5~35℃范围内,梨树离体枝条接种梨树腐烂病菌后均能发病并导致病斑扩展,25℃时病斑扩展速度最快,面积达4.45cm2,5℃和35℃时病斑扩展速度缓慢,面积不足0.3 cm2。该菌株在梨树树皮培养基中最适宜的产毒素温度为20℃,10~25℃条件下可产生5种毒素,而在其它温度下仅产生3~4种;接种该菌株的梨树离体枝条5℃条件下未检测到间苯三酚和对羟基苯甲酸,且毒素总量最低,其余温度下均可检测到5种毒素,最适宜的产毒素温度为10℃,毒素总量可达224.14μg/g干组织。     

地肤子提取物对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对其菌体结构和功能的影响

为开发新型安全高效的植物源苹果树腐烂病防治剂,采用菌丝生长速率法测定中草药地肤子乙醇提取物及各层析流分L1～L9对苹果树腐烂病菌Valsa mali的抑制作用,同时通过室内常规分析方法观测流分L7对该菌菌丝形态结构、细胞膜通透性及物质吸收和代谢的影响。结果表明,地肤子乙醇粗提物浓度为2 mg/mL时对苹果树腐烂病菌具有较强的离体抑制活性,处理后96 h的抑菌率达到92.16%。分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取醇提物,石油醚萃取物对苹果树腐烂病菌的抑制效果最为明显,其EC_(50)为0.07 mg/mL;在石油醚萃取物通过硅胶柱层析分离得到的9种流分中,流分L7对苹果树腐烂病菌的抑制作用显著,离体抑菌率高达96.73%;且在流分L7处理下,病菌菌丝体出现肿胀、膨大或畸形等现象,细胞膜通透性增大,可溶性蛋白、还原糖以及丙酮酸的含量随流分L7浓度的升高而持续降低,当浓度为100μg/mL时,菌丝体可溶性蛋白、还原糖及丙酮酸的含量分别降低70.78%、71.74%和78.68%。表明在离体培养条件下地肤子乙醇提取物能明显抑制苹果树腐烂病菌的生长,并对菌丝体细胞膜结构和功能稳定性产生显著影响,具有进一步开发为新型植物源苹果树腐烂病防治剂的潜力。     

苹果树腐烂病菌转录因子VmSte12的鉴定及功能分析

 Ste12是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转录因子。之后在部分丝状真菌中也发现了该类转录因子的存在,并证明其能够参与调控生殖生长以及病原真菌的致病力。然而,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中是否存在该类转录因子以及其功能尚不明确。本研究基于生物信息学鉴定苹果树腐烂病菌中Ste12的同源基因,采用烟草瞬时表达系统进行蛋白亚细胞定位分析,利用酵母单杂技术进行转录激活功能分析,进而利用PEG介导的原生质体转化技术构建基因缺失突变体,并对其进行表型观察与分析。结果表明,苹果树腐烂病菌存在Ste12的同源基因,我们将其命名为VmSte12。该基因编码701个氨基酸,包含Ste同源结构域和C₂H₂锌指结构域。VmSte12定位于细胞核,并具有体外转录激活功能。与野生型相比,VmSte12敲除突变体生长速率平均下降10.1%,分生孢子器数量平均下降94.6%,致病力平均下降27.4%。可见,VmSte12具有Ste12类转录因子特征,并且极有可能在腐烂病菌的生长、繁殖、致病等方面发挥重要作用。     

不同渗透压及pH环境对烟草青枯病菌致病力的影响

为探究不同渗透压和pH环境对烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum致病力的影响,用Biolog PM 9～10代谢板中96种渗透压和96种pH环境培养烟草青枯病菌,并采用穿刺法接种于烟草离体叶片,测定不同环境下烟草青枯病菌对烟草的致病情况。结果表明,烟草青枯病菌可致病的渗透压范围包括1%～2%氯化钠、2%～3%硫酸钠、5%～20%乙二醇、1%甲酸钠、2%尿素、1%乳酸钠、20～100 mmol/L磷酸钠、10～100 mmol/L硫酸铵、10～100 mmol/L硝酸钠及10～20 mmol/L亚硝酸钠。可致病pH范围为5.0～8.0;当pH 4.5时,烟草青枯病菌在分别与L-正缬氨酸和5-羟色氨酸共培养时均可致病,与其余33种氨基酸共培养时则均不能致病;当pH 9.5时,烟草青枯病菌在与所有35种供试氨基酸共培养时均不能致病;烟草青枯病菌在葡萄糖苷、辛酸盐、半乳糖苷等10种化合物培养下均可致病。表明渗透压和pH环境会严重影响烟草青枯病菌的生长和致病力。     

不同植棉省区落叶型黄萎病菌的培养特性及致病力比较

近年来落叶型症状的棉花黄萎病对棉花生产的危害越来越大,为明确落叶型棉花黄萎病菌的分化特点,采用特异性分子标记方法,对我国10个主要植棉省区30个落叶型棉花黄萎病菌的培养特性和致病力进行了比较。落叶型黄萎病菌系在我国主要植棉省区已普遍存在,该菌系以菌核型为主,其微菌核呈放射状或环状。63.3%菌系的菌丝发达致密,其余菌系的菌丝较为疏松。落叶型黄萎病菌系之间的产孢量和致病力差异较大,产孢量变幅为3.7×107～18.8×107个孢子/mL;71.9%为强致病力菌系,25.0%为中等致病力。研究表明,不同植棉省区间落叶型黄萎病菌系的产孢量和致病力具有一定差异。     

新疆不同地区葡萄霜霉病菌致病性分化及遗传多样性的分析

为了解新疆不同地区葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola的遗传特征,分别采用叶盘接菌法及SSR分子标记技术对采自新疆吐鲁番、阿克苏、石河子等11个不同产区的葡萄霜霉病菌菌株的致病性进行测定,并分析各菌株的遗传多样性。结果显示,来自新疆不同地区的菌株种内存在着致病性分化现象,依据其在鉴别寄主上致病性的差异,将供试菌株划分为强、中、弱3类,其中强致病性菌株为优势菌株,且种间致病性分化与菌株的地理来源无关;SSR标记结果表明,供试菌株之间存在遗传变异现象,并且菌株之间亲缘关系都较近,在相似系数为0.93时,48株菌株聚为4大类,且遗传分化与地理分布具有一定的相关性。研究表明新疆不同地区的葡萄霜霉病菌菌株之间存在致病性分化与遗传变异现象。