蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

蔗糖水解酶注释基因XC0805与野油菜黄单胞菌8004菌株的蔗糖利用及致病相关

 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是造成十字花科植物减产的重要病原菌,其通过水孔或伤口进入植物体内并在维管束中快速繁殖。光合产物(蔗糖)的运输主要依靠植物维管组织,同时蔗糖也是维管组织重要的能量来源。本研究利用生物信息学和遗传学等方法对Xcc中参与蔗糖利用的基因进行了分析,并研究了这些基因与其致病力的关系。Xcc 8004菌株中注释的参与蔗糖分解蛋白的编码基因有XC1002、XC1642、 XC1645和XC0805。 XC1002和XC1642的编码产物属于糖苷水解酶GH97蛋白超家族,而XC1645和XC0805的编码产物则属于GH13家族。突变分析发现除XC0805外,其他3个都不影响Xcc的蔗糖利用能力。接种实验表明,XC0805参与Xcc的侵染或在植物体内的生长,其他3个不参与致病过程。另外,Xcc 8004中预测参与蔗糖转运的基因(XC0806和XC0807)突变并不影响细菌的蔗糖利用和致病力,表明其可能存在其他的蔗糖转运通路。上述结果说明XC0805可能是Xcc 8004主要的蔗糖水解酶基因,且在致病中起重要作用。     

野油菜黄单胞菌效应蛋白AvrXccC与拟南芥BIK1在植物体内相互作用

 AvrXccC是野油菜黄单胞菌Xcc8004的一个III型分泌效应蛋白。前期研究发现AvrXccC在拟南芥rar1突变体上发挥毒性功能,并且抑制植物的先天免疫反应。但是,AvrXccC在植物体内的毒性靶标还不清楚。本研究发现AvrXccC与植物体内的蛋白激酶BIK1发生特异的相互作用。然而,在拟南芥原生质体中,AvrXccC 并不能抑制鞭毛蛋白诱导的BIK1迁移,表明AvrXccC不是通过抑制BIK1的磷酸化来发挥功能的。有趣的是,AvrXccC可以在体外直接被BIK1磷酸化,我们推测AvrXccC可能作为BIK1的底物从而干扰了鞭毛蛋白诱导的先天免疫反应。     

一个用于鉴定十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物分泌与转运的报告质粒的构建

 通过免疫检测的方法鉴定十字花科黑腐病菌(Xcc)Ⅲ型效应物的分泌和转运,将cyaA基因克隆至带有3×FLAG的pJXG载体上,构建带有3×FLAG和cyaA基因的报告质粒pJAA,并用已鉴定为Ⅲ型效应物的XC_1553启动子区信号区验证该报告质粒。将pJAA1553三亲导入Xcc 8004^*和8004^*ΔhrcV,然后通过Western blotting免疫检测XC_1553的分泌,结果在8004^*/pJAA1553的胞外蛋白中检测到了XC_1553的分泌,而在8004^*ΔhrcV/pJAA1553的胞外蛋白中没有检测到XC_1553的分泌。通过免疫反应定量检测8004^*/pJAA1553和8004^*ΔhrcV/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量,结果发现8004^*/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量比8004^*ΔhrcV/pJAA1553侵染后植物体内的cAMP含量高15倍。结果表明,报告质粒pJAA能够应用于鉴定十字花科黑腐病菌的Ⅲ型效应物。     

野油菜黄单胞菌效应蛋白XopXccN抑制鞭毛蛋白诱导的MAPK激酶活性

野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)通过III型分泌系统分泌效应蛋白到植物体内,帮助其在植物体内侵染和繁殖。XopXccN是野油菜黄单胞菌Xcc8004菌株的一个效应蛋白,利用同源重组双交换法将基因xop Xcc N在Xcc8004的基因组上做了删除突变,并对突变菌株进行了遗传互补。通过在拟南芥叶片上接种野生型Xcc8004、突变体菌株Δxop Xcc N以及互补菌株Δxop Xcc NC,发现效应蛋白XopXccN对于Xcc8004在拟南芥叶肉组织内的完整毒性是必须的。进一步研究发现,XopXccN可以抑制鞭毛蛋白诱导的MAPK激酶活性,其抑制发生在MKK下游。另外,XopXccN还可以抑制鞭毛蛋白诱导的下游标志基因FRK1(g22-induced receptor-like kinase)的表达。将XopXccN蛋白分段表达后发现,对于FRK1基因表达的抑制依赖于XopXccN的全长蛋白序列。本研究结果表明,XopXccN通过抑制M APK激酶活性,从而抑制寄主的先天免疫反应。     

野油菜黄单胞菌AvrXccE1是一个毒性/无毒性双功能Ⅲ型效应蛋白

植物病原细菌通过III型分泌系统将大量的效应蛋白分泌到宿主细胞内,从而抑制宿主的先天免疫。效应蛋白Avr Xcc E1广泛存在于黄单胞菌中,然而关于Avr Xcc E1具体的作用机理尚不清楚。本研究利用野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)和拟南芥互作模式系统,发现来自Xcc8004菌株的效应蛋白Avr Xcc E1对于Xcc8004在拟南芥上的全毒性是必须的,并且Avr Xcc E1可以抑制病原细菌鞭毛蛋白Flg22诱导的FRK1(Flg22-induced receptor-like kinase)基因表达,但并不抑制Flg22诱导的M AP激酶活性。通过Avr Xcc E1与GFP蛋白的融合表达,证实效应蛋白Avr Xcc E1定位在细胞膜上,并且细胞膜定位对于Avr Xcc E1在拟南芥上发挥毒性功能和在大白菜品种"中白83"上发挥无毒功能是必须的。     

十字花科黑腐病菌IV型分泌系统的诱导表达与抗逆功能分析

 细菌通过IV型分泌系统(Type IV Secretion System, T4SS)的接合系统、效应物转运系统和释放/吸收系统3个子家族进行DNA、蛋白质及毒素的分泌和转运。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种重要的植物病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。本研究通过检测Xcc 8004野生型菌株和T4SS突变体在不同条件下的生长、诱导情况及对过敏反应的影响发现:T4SS不影响在培养基中的生长,与野生型菌株相比,T4SS突变体在非寄主辣椒ECW-10R上的过敏反应减弱;T4SS相关基因受基本培养基MMX诱导表达,且与Ni²⁺、H₂O₂、Phenol等抗逆相关。推测T4SS相关基因在该病原菌的接触、识别阶段起作用。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

西瓜噬酸菌中C-di-GMP代谢相关基因Aave_2620的功能研究

 环鸟苷二磷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是一种广泛存在于植物病原细菌中的第二信使,调控细菌多种生物学功能,从而影响病原细菌的致病性,但其在西瓜噬酸菌中的研究还未见报道。本实验以Aac5菌株为研究对象,通过构建c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620缺失突变株和互补菌株,从其致病能力及其生长能力两部分进行测定,探究此信号途径是否在西瓜噬酸菌中调控致病机制。结果表明,基因Aave_2620的缺失显著降低Aac5菌株致病力、生物膜形成能力和生长能力,减弱烟草过敏性反应以及运动能力,互补菌株表型基本得到恢复。基因Aave_2620的缺失显著影响三型分泌系统相关基因、毒性相关基因以及鞭毛及趋化性相关基因在西瓜噬酸菌中的表达量。以上结果表明c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620与西瓜噬酸菌的致病密切相关。     

瓜类细菌性果斑病菌hrcN基因的生物学功能分析

以分离自西瓜上的Aac5菌株为例,通过同源重组的方法,构建了hrc N基因插入缺失突变体,通过PCR方法和Southern blot验证突变菌株,对突变体进行致病性、致敏性、生长曲线和运动性测定。为明确hrc N基因与其他基因的关系,通过实时荧光定量PCR法定量检测了hrp A、hrc V、hrc U、Lux I、LuxR 5个基因的表达量。结果显示:与野生型相比,突变体致病力和致敏性明显减弱,致病时间延迟,群体感应信号减弱,生长能力明显下降,运动性减弱,互补菌株只能恢复部分功能;5个基因在突变体中的表达量均上调,hrc N基因与这5个基因之间均为负调控关系。说明hrc N基因在果斑病菌致病能力上发挥重要作用。     

进境韩国大花蕙兰上唐菖蒲伯克氏菌的分离鉴定及生物学研究

 大花蕙兰（Cymbidium hybridum）,又名虎头兰、喜姆比兰,兰科、兰属多年生草本植物,是近几年我国花卉市场上流行的高档室内盆栽花卉。大花蕙兰的杂交育种已有一百多年的历史,每年新增加的品种有几十种之多。近年来,我国检验检疫部门分别从各入境口岸的进境大花蕙兰中多次发现携带有菊基腐病菌（Erwinia chrysanthemi）、兰花细菌性褐腐病菌（Erwinia cypripedii）、建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus）等多种病原生物,均有潜伏期长、发病率高等特点。入境大花蕙兰种苗携带植物病原细菌、病毒等有害生物隐蔽性强、风险较高。     

苎麻叶斑病病原菌鉴定

 苎麻\[Boehmeria nivea（L.）Gaud\]属荨麻科（Urticaceae）苎麻属（Boehmeria）,多年生宿根性草本植物。我国苎麻栽培历史悠久,病害及病原种类多。2010年,在重庆璧山丁家镇高古村苎麻种植区发现一种新病害,该病菌主要为害苎麻叶片,病害蔓延迅速且危害严重,严重时病叶率达50%以上,给当地苎麻产业造成严重损失。为了明确该病害的病原菌种类,本文通过形态学鉴定和致病性测定,结合分子生物学技术对病原菌进行系统鉴定,确定该叶斑病的病原菌为多主棒孢（Corynespora cassiicola）。     

Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestris into three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. campestris

The species Xanthomonas campestris (Vauterin) groups bacteria associated with cruciferous plants. In order to clarify and refine the pathovar and race structures within X . campestris , 47 representative strains of six pathovars were characterized for their pathogenicity on a large host range of Brassicaceae, including all original hosts. Three diseases were observed on tested plants: (i) black rot disease on cruciferous plants; it was proposed that all strains causing black rot on at least one cruciferous plant be grouped in the single pathovar X . c . pv. campestris ; (ii) leaf spot disease caused by X . c . pv. raphani on hosts belonging to the Brassicaceae and Solanaceae; the sequenced strain 756C identified as X . c . pv. armoraciae was included in this pathovar and the existence of another leaf spot disease caused by X . c . pv. armoraciae was not supported; and (iii) bacterial blight of garden stocks caused by X . c . pv. incanae . No plants susceptible to X . c . pv. barbareae were found. Strains that did not induce any symptom on cruciferous plants tested, including their original hosts, were removed from the pathovar scheme and were named X . campestris only. Three new races were described in addition to the six races previously described within X . c . pv. campestris . The sequenced strains ATCC 33913 (CFBP 5241) and Xcc 8004 (CFBP 6650) belonged to race 3 and to race 9 (one of the new races described), respectively.     

稻瘟病菌MoCOS1基因调控MoCMR1基因表达的研究

 以往研究证明MoCOS1可能是一个新型的转录因子,其突变体不产生分生孢子,黑色素合成明显减少。经过RNA-Seq分析,发现受MoCOS1调控的基因达到442个,其中MoCMR1的表达水平受到MoCOS1的下调。本研究中通过实时定量PCR进一步证实MoCOS1基因突变导致MoCMR1基因表达水平下降。基因MoCMR1突变后,黑色素产量略有减少,但分生孢子形态及产量和MoCOS1的表达量没有发生变化。     

大豆中疫霉诱导性GmDRRP基因启动子的克隆与功能分析

本研究根据大豆与疫霉互作的基因芯片数据,筛选了一个受疫霉诱导表达的大豆抗病相关基因(Gm DRRP,glycine max disease resistance response protein),并对其启动子响应疫霉侵染的功能进行了研究。序列分析表明该基因编码一个大豆抗病相关蛋白。分别用SA、Me JA、ABA、ETH和GA3五种激素处理后,发现该基因的表达受激素的抑制。克隆其转录起始位点上游1 590 bp的启动子区,生物信息学分析发现该区域包含多个已知与逆境响应相关的顺式元件。进一步将启动子构建在融合Gus报告基因的植物表达载体上,分别瞬时转化烟草和稳定转化大豆根毛,并检测了Gus报告基因的表达情况。结果表明,Gm DRRP启动子均能在两种体系中不同程度的受疫霉诱导,其表达模式为接种后0.5 h被快速诱导,并在2 h时显著提高。根据生物信息学对顺式元件的预测结果,对启动子进行了分段分析,获得了一个222 bp的小片段,其疫霉诱导表达能力是全长启动子的34%。以上结果表明大豆的Gm DRRP启动子能被疫霉快速诱导。     

Inhibition of prepenetration processes of the powdery mildew Golovinomyces orontii on host inflorescence stems is reduced in the Arabidopsis cuticular mutant cer3 but not in cer1

The obligate biotrophic fungus Golovinomyces orontii causes powdery mildew (PM) disease on its host Arabidopsis thaliana. Most research on the G. orontii–Arabidopsis pathosystem uses rosette leaves as experimental materials, so little is known about the behavior of G. orontii on other Arabidopsis organs. We thus conducted microscopic analyses of the PM infection process on leaves, stems, fruits and roots of Arabidopsis. Adaxial and abaxial surfaces of mature rosette leaves supported G. orontii infection, but growth was somewhat suppressed on cauline leaves. Prepenetration processes (germination and appressorium formation) were strongly inhibited on stems, fruits and roots. To test the effect of alterations in the Arabidopsis cuticle on the inhibition of prepenetration processes on stems, we used cuticle mutants of Arabidopsis eceriferum (cer) cer1 and cer3. Both mutants had been characterized for reduction in cuticular wax, but our chlorophyll leaching assay revealed increased cuticle permeability only in cer3. Mature rosette leaves and stems of cer1 and cer3 were inoculated, and prepenetration inhibition on stems was found to be significantly reduced in cer3 but not in cer1. We discuss the function of the cuticle in prepenetration inhibition, as well as our finding on suppression of G. orontii growth and reproduction on cer3 rosette leaves.     

芝麻枯萎病病原菌致病力室内鉴定方法

 芝麻枯萎病(Sesame Fusarium wilt, SFW)是由尖孢镰刀菌芝麻专化型(Fusarium oxysporum Schl. f. sp. sesami (Zap.), FOS)引起的一种土传真菌病害, 是世界芝麻生产上的主要病害之一。为测定FOS致病力, 本文选用郑芝98N09等4个芝麻品种, 在苗期对15个FOS菌株的致病力强弱进行了室内鉴定和评价。结果表明, 采用1×10⁶个/mL分生孢子悬浮液与无菌蛭石和无菌土壤按V1∶V2∶V6比例混合接菌(即最终接菌浓度为1.4×10⁵孢子/g土壤), 在接菌后第7 d幼苗开始出现枯萎病症状, 调查菌株致病性的最佳时间为接菌后第25 d~28 d;在供试15个FOS菌株中, 对4个品种均表现为强致病力的菌株有8个(DI>50), 均表现为弱致病力的菌株有5个(DI<20);不同芝麻品种对不同菌株的抗性有一定差异。该方法可应用于芝麻枯萎病病原菌致病性测定和芝麻种质抗枯萎病特性评价, 并为后续的机理研究提供了技术支持。     

枯草芽胞杆菌NCD-2中调控因子PhoP对fengycin合成的调控作用

 PhoR/PhoP双因子调控系统是枯草芽胞杆菌中一个重要的全局性调控系统, 在低磷环境下, 感应激酶PhoR自磷酸化, 并且将获得的磷酸基团转移到调控因子PhoP上, 从而激活PhoP的调控活性。为了明确调控因子PhoP对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中主要抑菌活性物质-fengycin合成能力的调控作用, 本研究通过同源重组技术缺失突变NCD-2菌株中的phoP基因, 拮抗活性测定结果表明, phoP基因缺失菌株显著降低了对立枯丝核菌的抑菌活性。通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)技术比较了NCD-2菌株野生型及其phoP基因突变子fengycin的合成能力, 结果证明, phoP基因突变菌株降低了fengycin的合成能力。对突变子进行phoP基因互补发现, 互补phoP基因可使突变子的相关性状恢复到野生型菌株水平。以上结果证明, phoP基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株中fengycin的合成具有正调控功能。