TAPHS1基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的相关分析

TAPHS1基因是MFT-like基因,可调控小麦成熟期的籽粒休眠(影响穗发芽抗性)且与开花的发育控制相关,位于小麦3A染色体短臂上。为探究该基因序列多态性与小麦生殖发育稳定性的关系,设计PCR引物扩增TAPHS1基因的2个高频变异区,获得86个品种相应基因区段的DNA序列信息;以不同播期之间抽穗期相差时间为指标调查评价各品种的生殖发育稳定性。结果表明:在TAPHS1基因的高频变异区存在5种多态性,将其命名为A类、B类、C类、D类、E类;A类、B类、C类属非编码区多态性,D类及E类同时涉及编码区和非编码区多态性;D类及E类序列多态性与生殖发育稳定性相关,并根据D类序列信息开发了分子标记。     

海马齿SpSCL1基因启动子克隆及序列分析

GRAS蛋白是植物特有的一类蛋白家族,在植物的生长发育方面具有重要作用.根据前期分离的海马齿SpSCL1基因的5'端序列,设计特异引物进行Genome Walking,从海马齿基因组DNA中克隆了SpSCL1基因上游的1 254 bp片段.序列分析表明,该序列包含681 bp的启动子调控序列及573 bp的基因编码序列,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、耐盐和光响应相关的顺式作用元件.结果预示海马齿SpSCL1可能在抗旱、耐盐以及光敏色素信号转导途径中发挥重要作用.     

基于SNP标记的桃矮化基因精细定位

【目的】矮化型桃树体矮小、节间短,是盆栽观赏和砧木育种的重要遗传资源。明确矮化性状形成的遗传机制并对桃矮化基因进行精细定位,是建立目标性状分子辅助选种体系和遗传改良的前提,可为有目标的选育矮化观赏桃和砧木品种奠定基础。【方法】以‘05-2-144’(‘97矮’ב鸳鸯垂枝’桃)套袋自交获得的395个后代单株构建的分离群体为材料。参考桃基因组信息并基于Sanger技术开发的SNP标记对亲本和后代单株进行分析,在扩大群体单株中进行连锁关系分析,确定连锁的SNP标记,初步定位目标基因。在定位区域内基于二代测序技术开发更多的基因型和表型一致的SNP标记,对后代单株进行基因分型,完成目标性状的精细定位。然后在精细定位区域内开发SNP标记,即杂交群体双亲均为Aa杂合基因型,对‘10-7’ב96-5-1’杂交后代89个单株进行分子鉴定,以验证基因定位结果的准确性。【结果】通过对桃单株‘05-2-144’自交后代实生苗表型鉴定表明,普通型和矮化型单株数分别为300株和95株,性状分离比例接近3﹕1(P值为0.67;χ2为0.19),符合孟德尔遗传规律,桃矮化性状受隐性单基因控制。用于分子鉴定的单株来源于‘10-7’(普通型)ב96-5-1’(普通型)杂交组合,共获得89个后代单株,其中普通型66株;矮化型23株(P值为0.854;χ2为0.034)。基于Sanger测序技术开发了SNP标记,在桃基因组数据库Pp06上25 230 425 bp和27 191 090 bp处获得了连锁的SNP标记,且目标基因位于这两个标记的右侧,初步获得了连锁的SNP分子标记。在此基础上,对亲本进行66.89X深度测序,继续开发符合Aa杂合基因型的SNP标记位点。根据参考基因组和物理距离区间共设计了15对SNP引物,其中12对引物与重测序结果中SNP的类型一致,3对引物与重测序结果中SNP的类型不一致,连锁标记的基因分型成功率为80.0%。通过基于SNP基因分型分析,最终完成了目标性状的精细定位,位点位于Pp06的28 712165 bp(引物为JXSNP-5)和28 899 661 bp(引物为JXHRM-SNP-3)之间,遗传距离分别为0.38 c M和0.13 c M,物理距离约为277 kb,精细定位区域内有54个已知转录本。在定位区域内桃基因组Pp06的28 108 436 bp处和29 247 763 bp处开发SNP标记用于杂交后代表型的鉴定,结果表明所有后代单株基因型和表型鉴定结果完全一致,鉴定准确率为100%。【结论】本研究精细定位了桃矮化基因,物理距离约为277 kb,为基因克隆、亲本早期筛选以选育矮化观赏桃和砧木品种等奠定了基础。     

魔芋GDP甘露糖焦磷酸化酶基因及其启动子的克隆与分析

以花魔芋和白魔芋为材料,通过魔芋5个转录组高通量测序数据库,与拟南芥进行tBlastn比对、拼接,得到魔芋中的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP的推定全长,设计基因特异性引物,克隆得到魔芋GMP基因的部分cDNA序列,长度为1 233 bp,其中基因编码区长度为1 086 bp,编码的氨基酸为361个.在此基础上运用FNPI-PCR技术得到了魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP上游启动子2 116 bp,经生物信息学分析,该序列具有典型的TATA-box、 CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.     

嵌套式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别体系的建立

应用源自牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6,进行嵌套式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样DNA及牛胚胎样DNA进行特异性条带的嵌套式PCR扩增,并对外、内嵌套式引物的PCR反应体系进行了优化,以准确鉴定牛早期胚胎性别.结果表明,在优化了的PCR反应体系下,中国荷斯坦公牛DNA样品得到178bp和262bp的两个条带,而母牛仅得到262bp的1个条带;静脉血样DNA性别鉴定结果与实际性别相符率为100%,表明本试验建立的体系完全可以用于牛早期的胚胎性别鉴定.     

Isolation and Analysis of α-Gliadin Gene Coding Sequences from Triticum durum

Three coding sequences of gliadins genes, designed as Gli2_Dul, Gli2_Du2 and Gli2_Du3, were isolated from the genomic DNA of Triticum durum accessions CItr5083. Gli2_Dul and Gli2_Du2 contain 945 and 864 bp, encoding the mature proteins with 314 and 287 amino acid residues, respectively. Gli2_Du3 is recognized as a pseudogene due to the stop codon occurring in the coding region. The pseudogenes, commonly occurring in gliadins family, are attributed to the single base change C→T. The amino acid sequences deduced from these gene sequences were characterized with the typical structure of α-gliadin proteins, including the toxic sequences （PSQQQP）. The peptide fraction PF（Y）PP（Q）is thought to be an extra unit of repetitive domain, slightly diverging from the previous report. Six cysteine residues were observed within two unique domains. Phylogenetic analysis showed Gli2_Du2 and Gli2_Du3 were closely related to the genes on chromosome 6A, whereas Gli2_Dul seems to be more homologous with the genes on chromosome 6B.     

Identification and Gene Mapping of a multi-floret spikelet 1 (mfs1) Mutant Associated with Spikelet Development in Rice

In this study, a rice spikelet mutant, multi-floret spikelet 1 (mfs1), which was derived from ethylmethane sulfonate (EMS)-treated Jinhui 10 (Oryza sativa L. ssp. indica) exhibited pleiotropic defects in spikelet development. The mfs1 spikelet displayed degenerated the empty glume, elongated the rachilla, the extra lemma-like organ and degraded the palea. Additionally, mfs1 flowers produced varied numbers of inner floral organs. The genetic analysis revealed that the mutational trait was controlled by a single recessive gene. With 401 recessive individuals from the F₂ segregation population, the MFS1 gene was finally mapped on chromosome 5, an approximate 350 kb region. The present study will be useful for cloning and functional analysis of MFS1, which would facilitate understanding of the molecular mechanism involved in spikelet development in rice.     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

牛FoxO1基因启动子转录调控分析

为鉴定牛叉头框转录因子1(Forkhead box,FoxO1)的核心启动子区及其关键转录因子,利用PCR扩增牛FoxO1基因的启动子序列,同时设计7个逐段缺失片段引物扩增其启动子逐段缺失片段,进一步将其构建双荧光素酶报告载体并分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系,通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性,以确定牛FoxO1启动子的核心区域;使用Genomatix和JASPAR在线软件预测牛FoxO1基因启动子核心区域的关键转录因子,采用定点突变试验在小鼠C2C12细胞系中初步鉴定预测的关键转录因子对FoxO1的转录调控作用。结果表明：1）成功扩增了牛FoxO1的启动子区1 920bp序列,获得了FoxO1基因启动子序列的7个逐段缺失片段序列;2）经双荧光素酶报告试验进一步证实,牛FoxO1基因核心启动子位于-285/-27区域;3）预测并通过定点突变试验鉴定出MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5转录因子对FoxO1基因的转录活性具有关键调控作用。综上,本研究初步鉴定出牛FoxO1基因启动子核心区（-285/-27）内转录因子MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5对F...     

巢式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别的研究

源于牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6进行巢式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样及牛胚胎样进行特异性条带鉴定。结果表明,中国荷斯坦公牛出现178bp和262bp2条带,而母牛仅出现262bp1条带;静脉血样与实际性别相符率为100%;巢式PCR胚胎性别鉴定技术方法准确、简便,具有很高的灵敏性及稳定性。     

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase,Tre-1）全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性,为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列,利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段;随后根据该片段设计基因特异性引物,用RACE方法获得5'端和3'端片段。在此基础上,根据RACE扩增所得片段和保守序列,预测开放阅读框（ORF）序列,分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF,最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR技术,采用2^-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3 129 bp,命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078）,其中包含5'端441 bp非编码区和3'端945 bp非编码区,ORF为1 743 bp,共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD,等电点为5.95;有1个信号肽结构（1-21位）,1个甘氨酸富集区（GGGGEY）,2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP）,6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列,无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性很高,分别为99%和98%,与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的Tre-1一致性也达到78%;系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近,与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达,在中肠的表达量最高,其次是马氏管,其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹,工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律,在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列,其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似,该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高,此外,幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂,工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势,为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。     

牡山羊草细胞质雄性不育小麦败育的生物学特性和细胞学研究

为明确牡山羊草细胞质雄性不育小麦的染色体组成及雄性败育特点,采用分子标记技术和酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对牡山羊草细胞质雄性不育小麦是否含有1BL/1RS易位染色体进行了鉴定。另外,为揭示牡山羊草细胞质雄性不育小麦败育发生的时期和败育的细胞学机理,以牡山羊草细胞质雄性不育小麦(Ju87B1-706A)和其同型保持系(706B)为供试材料,采用I2-K染色、醋酸洋红染色、DAPI染色和石蜡切片法对其花药形态特征及小孢子形成和发育过程进行细胞学观察。结果表明:Ju87B1-706A具有黑麦1RS的特异扩增条带(1 500bp),但缺少1BS的特异扩增条带(220bp),与其在A-PAGE结果的ω区与黑麦特异蛋白谱带的结果相对应,从而说明牡山羊草细胞质雄性不育小麦Ju87B1-706A为1BL/1RS雄性不育小麦类型;I2-K染色说明Ju87B1-706A的败育类型为典败和染败;Ju87B1-706A能正常进行减数分裂形成小孢子,到单核晚期时能形成正常的核但细胞皱缩,二核期细胞形态不规则能形成正常的精核但有些营养核不清晰,三核期精核呈圆形不能形成梭形的精核并发生部分空胞化;其单核晚期花药中绒毡层的延迟解离以及二核期三核期细胞团侵入药室造成小孢子败育,从而推测单核晚期是其雄性不育发生的关键时期,可能与绒毡层异常有关。     

甜瓜种皮颜色控制基因CmSC1的精细定位及候选基因分析

【目的】通过对甜瓜种皮颜色进行遗传分析及基因精细定位,并推测其候选基因和开发特异分子标记,为下一步该基因的功能研究及合理利用奠定基础。【方法】利用白色种皮材料HP22和黄色种皮材料B8、B150分别配制杂交组合,获得后代遗传分离群体并进行种皮颜色的表型调查及遗传分析,通过基因图位克隆方法完成基因的精细定位。通过对定位区间内注释基因进行编码区序列和功能分析确定关键候选目的基因。【结果】甜瓜白色种皮对黄色种皮为显性,由单显性基因CmSC1控制并表现延迟遗传效应。利用368个黄色种皮F₂单株最终将CmSC1精细定位于第5号染色体分子标记S27和S28之间物理距离约95 kb区间内,共包含12个注释基因。其中一个为拟南芥AtTT8同源的编码bHLH转录因子蛋白的MELO3C014406,经序列变异位点分析,黄色种皮材料B8和B150分别在该基因ATG下游第47位碱基处插入碱基A以及在第260位碱基处缺失14 bp导致翻译蛋白提前终止,致使后面功能结构域完全缺失,进而通过开发特异分子标记YS及序列分析,发现65份黄色种皮材料均发生这两种突变形式中的一种,推测MELO3C014406即为控制种皮颜色CmSC1的目的基因。【结论】本研究将控制种皮颜色的CmSC1精细定位于第5染色体95 kb区间内,推测MELO3C014406为最终目的基因,并开发了特异分子标记YS。     

甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因（Sc-ERS）的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因（AY359578）、水稻乙烯受体ERS1基因（AY043031）编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。     

亚东鲑基因组中Tc1-like转座子的序列歧化特征分析

根据鱼类Tc1-like超家族转座子的末端反向重复序列设计单引物,对西藏亚东鲑基因组进行PCR扩增、回收、克隆和测序,鉴定出亚东鲑两条长度为1 607 bp和1 473 bp的Tc1-like超家族转座子序列,命名为Tbt1和Tbt2。序列分析表明,亚东鲑Tbt1转座子左右两端分别存在一个196 nt和225 nt的末端反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITR),在左右ITR中分别包含2个12 nt的亚末端反向重复序列(Subterminal inverted repeats,SIR);亚东鲑Tbt2转座子分别存在一个32 nt和31 nt短的ITR,其左右ITR中各仅包含1个12 nt的SIR。亚东鲑Tbt1、Tbt2转座子的转座酶编码区在进化过程中各已积累了4个和9个终止突变,两者均不能表达完整的转座酶。亚东鲑Tbt2与其它鲑科鱼类Tc1-like转座子的相似度低于30%,而与金鱼Tca2转座子的序列相似度高达98%,显示该转座子的获得可能起源于基因水平转移(horizontal gene transfer,HGT)方式。     

PCR-based screening of BAC clones of different chromosomes in Chinese cabbage

In this paper, taking SSR and functional gene sequence as the primers and the plasmid of first- and second-level pools of bacterial artificial chromosome (BAC) library as templates, the PCR method was used for specific clones of different chromosomes in Chinese cabbage. The results showed that the number of positive clones was 1?C11 per primer and the average number of clone was 3.9 by screening 19200 clones of BAC library using 12 pairs of SSR primers from 10 linkage groups individually, which were nearly consistent with about 3.4 times of genome coverage. Positive clones were acquired in chromosome Nos. 2 to 5 and 8 to 10 without screening with the positive clones in chromosome Nos. 1, 6, and 7. In addition, the primer of FLC1 functional gene of chromosome No. 10 was used for PCR screening, and two BAC clones containing FLC1 gene were acquired. Therefore, different specific BAC clones of chromosomes were taken by using SSR primer and functional gene primer. Specific clone screening of chromosomes could provide a probe for identifying the chromosome accurately. Meanwhile, the BAC library screening method was optimized, serving as an effective technical means for quick BAC clone screening.     

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification on of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列.该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1 373 bp,与已知NHXI序列同源性最大为80;,其编码区1 094 bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated resion,3'trm)长度为239 bp.3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97;、45.63;和40.64;,明显低于编码区的同源性.结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础.     

海岛棉GbMYB25基因的克隆及表达分析

根据陆地棉GhMYB25的序列,设计1对引物,通过RT-PCR技术从海岛棉品种新海21号中克隆了1个同源基因,命名为GbMYB25。GbMYB25基因具有1个930bp的开放阅读框,编码309个氨基酸,预测分子量约为34.762ku,等电点为8.08,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GbMYB25基因序列包含2个内含子。氨基酸序列比对表明,该蛋白和其他高等植物的MYB蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GbMYB25基因和陆地棉GhMYB25基因处在同一进化树分支。亚细胞定位表明GbMYB25基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明GbMYB25基因在胚珠(0doa)、纤维(5dpa)和叶片中的表达量较高。以上结果表明,GbMYB25转录因子可能参与棉花纤维发育。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方分离株

根据IBV Beaudette株全基因组序列，借助基因分析软件自行设计合成了3个引物（youl,you2-youM ),引物you1 和you2-在S1基因两则，跨幅为1611bp,引物you2-和youM 在S1基因的3‘端，跨幅为535bp，用引物you1 和you2-对5个IBV地方分离株（HN2、HN4、JX1、SC2和SC4）进行RT－PCR，均成功地扩增出预期大小的目的片段，对RT－PCR的产物用限制性内切酶PstI进行酶切分析，结果酶切产物中得到2条条带，大小分别为560和1050bp，与GeneBank中11株已发表的S1基因分析结果一致，初步鉴定结果显示，已经成功分离得到了IBV－S1基因。