草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

玉米sbe2a基因RNAi载体的构建及转化玉米的初步研究

采用PCR技术克隆了玉米淀粉分支酶sbe2a基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并进行序列分析.结果表明:克隆片段长度为562bp,将该基因的正义和反义片段插入到pCAMBIA1301改造过的载体p35-1301的35S启动子下游,构建高效RNAi表达载体,通过花...     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因反义表达载体的构建

本实验用设计好的两条75bp的长引物进行PCR反应，扩增出甜瓜PGl基因的128bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体中，筛选反向克隆，然后将其反向构建到植物表达载体pUC38-ACC的CaMV35S启动手和TMV增强子“Ω”的下游，构建成反义表达载体pUC38-PGo用PCR鉴定重组子，并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体，为用花粉管法将其导入河套蜜瓜，培育转基因耐储河套蜜瓜奠定了基础。     

大豆胰蛋白酶抑制剂KSTI3基因的克隆及其植物表达载体的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654 bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入根癌农杆菌EHA105中,获得了植物表达载体。     

蝴蝶兰ACC合成酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

［目的］克隆蝴蝶兰ACC合成酶cDNA片段,构建其反义表达载体。［方法］根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶的基因序列,设计并合成了1对引物,通过RTPCR以蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC合成酶的cDNA片段,将其连接到MD19T质粒载体上进行测序。用XbaⅠ和SacⅠ对重组质粒和pBI221酶切后连接,构建蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结果］获得了蝴蝶兰ACC合成酶的cDNA片段,测序结果显示,该片段与参考的已报道序列具有98.92%和76.36%的同源性。通过引入XbaⅠ和SacⅠ酶切位点,进行载体构建,构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结论］成功构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因植物表达载体,为进一步研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础。     

薄皮甜瓜果实ACC合成酶cDNA克隆及反义表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(Cucumis melo cv.Qitian I)果肉组织中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到0.7 kb的cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-T Easy。测序表明,该基因为777 bp,编码258个氨基酸,与Gen-Bank中甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因比对,核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为98%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pCAM2301的E8启动子和NOS终止子之间,构建成E8调控下ACS基因反义表达载体。通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。     

柑橘CitSERK基因正义与反义表达载体的构建及其体系优化

以Kpn I和XhoI双酶切带有CitSERK基因cDNA全序列的T/A克隆载体,同时以Kpn I和XhoI双酶切PMV载体,凝胶回收目的基因片段及PMV载体骨架片段,成功构建了CitSERK基因正义与反义表达载体,并对遗传转化载体构建体系进行了优化。结果表明:以Kpn I和XhoI双酶切带有CitSERK基因的T/A克隆载体和PMV载体,成功得到带有Kpn I和XhoI双酶切位点的目的基因片段和PMV载体骨架片段;酶切检测结果显示,阳性克隆成功酶切出预期大小的CitSERK基因片段和PMV载体骨架片段;2对特异引物PCR检测结果显示,阳性克隆同时扩增出预期大小的CitSERK基因片段。     

加工番茄PG基因片段的cDNA克隆及表达载体构建

从加工番茄红熟果实中提取总RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经过反转录PCR,扩增出一条697bp的目的片段。通过TA克隆,把它连接到pMD18-T vector上,测序鉴定其正确性。扩增片段经Sal I和Sma I双酶切插入到表达载体pBinAR CaMV 35S启动子和OCS终止子之间,用M13测序引物和目的片段引物进行PCR扩增鉴定,构建成含有PG基因片段的反义表达载体pBinAR-aPG,为进一步对加工番茄的遗传转化奠定了基础。     

黄河蜜甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶基因片段的克隆和反义载体的构建

从伤诱导的黄河蜜甜瓜(Cucumismelocv.Huanghemi)成熟果实的中果皮组织中分离总RNA,经反转录和PCR扩增得到974bp的cDNA片段,克隆到质粒载体pGEM-3zf,经测序与Genbank中甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶(1-amino-cyclopropane-1-carboxylieacidsynthase,ACS)基因同源性为99%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建成ACS基因的反义表达载体。     

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒多基因重组腺病毒载体的构建

采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代.     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶磷酸化位点的突变及相应表达载体的构建

用Clontech公司的定点突变试剂盒TransformerTMSite-Directed Mutagenesis Kit对克隆载体pMD18T-SPS3L上的SPS基因SPS3L进行定点突变,使其459位的丝氨酸密码子分别突变为编码苏氨酸、丙氨酸和谷氨酸的密码子。然后将突变后的和未突变的SPS3L基因分别克隆至表达载体质粒pCAMBIA1301中,构建重组质粒pCAMBIA1301-SPS3L。经测序鉴定,对SPS3L基因的定点突变成功,构建表达载体pCAMBIA1301-SPS3L成功。     

甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建

根据C,enBank中登记的甜瓜八氢番茄红素合成酶（CmPSY）基因序列设计引物,利用lit—PCR技术克隆了甜瓜PSY全长基因,该基因全长1443bp,编码421个氨基酸,在GenBank中登记号为GU361622。以＆帆HI和剐I双酶切pMDI8-T—CmPSY和表达载体pBI121,再将回收的目的片段与pBI121用T4 DNA连接酶连接,结果证明,渊y正向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmPSY的重组质粒。该研究为了解甜瓜八氢番茄红素合成酶的活性调节机制,并通过基因工程手段研究甜瓜PSY的活性奠定了基础。     

苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶亚基基因MdCKS表达载体的构建

根据GenBank上与周期蛋白依赖性蛋白激酶基因相关序列,从苹果MdCKS基因编码区设计带有XbaI和SalI酶切位点的引物。以富士MdCKS基因的eDNA为模板将PCR扩增片段连接到pMD18-TSim-pieVector上,测序正确后,再连接到植物表达载体pBII21上,经过抗性筛选和测序验证,成功构建了MdCKS基因表达载体。并通过电击转化法导入农杆菌LBA4404,以备将来用于番茄转化。     

木薯醇腈酶在枯草芽孢杆菌中的表达及活性检测

醇腈酶(α-hydroxynitrile lyase,HNL)能够催化羰基化合物和HCN立体选择性的加工形成手性醇腈化合物。以含有木薯醇腈酶基因的重组质粒pET28a-HNL为模板,应用PCR扩增得到HNL基因,将其连接到pMD18-T载体中进行测序分析,然后通过Nde I和Xba I2个酶切位点将其连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5Z2中,获得了含有HNL基因的重组质粒pMA5Z2-HNL,转化蛋白质三缺陷的枯草芽孢杆菌DB1342。SDS-PAGE显示HNL在枯草芽孢杆菌DB1342中获得表达,产物分泌到细胞外,每毫升发酵液中获得了2.108 U的醇腈酶。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

笔者以山羊痘病弱毒疫苗毒株TK基因内KpnI为插入位点,构建了表达绿色荧光蛋白和小反刍兽疫（PPR）H基因的重组山羊痘病毒通用转移载体,为今后研究羊痘病毒活载体疫苗奠定基础。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定(英文)

[Objective] This study was to develop a live vector vaccine of goat pox virus of Peste des petits ruminants(PPR). [Method] Using PCR amplification technique, PPR H gene was obtained, then ligated into pGEM-T easy vector; the recombinants were digested by Nhe Ⅰ and Hind Ⅲ, and ligated into pEGFP-N1-P7.5, yielding the recombinant vector pEGFP-N1-P7.5-H; next the expression cassette EGFP-N1-P7.5-H was first released from recombinant vector pEGFP-N1-P7.5-H by double digestion of Hind Ⅲ and Nhe Ⅰ and ligated into pUC119-TK that was digested by Kpn Ⅰ, yielding the transfer vector pUC119-TK-EGFP-P7.5-H. [Result] Identification and double enzyme digestion showed that the transfer vector pUC119-TK-EGFP-P7.5-H was correctly constructed. From the transfer vector transfected BHK-21 cells which infected GTPV AV41, specific fluorescence was observed at 48th h of transfection. [Conclusion] The construction of goat poxvirus live vector laid a foundation for the live vector vaccine of PPR vaccine.     

黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其酵母表达载体构建

以黑曲霉A9基因组为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)直接对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经DNA测序,该基因为1 743 bp,编码581个氨基酸。该基因序列已在GeneBank注册,登录号为DQ836361。用限制性内切酶切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-GOD。重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-GOD的构建,可望获得超量表达的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。