伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

猪伪狂犬病进口与国产gE基因缺失活疫苗免疫效果的比较

[目的]了解猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的免疫效果,同时制定合理的免疫程序。[方法]选用国产和进口2种猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗,采用2种不同的免疫程序进行了免疫对比试验。[结果]无论是用国产的还是进口的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫,试验猪10、20、30、40、50、60、70日龄猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著(P>0.05);80日龄,实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值显著高于2次免疫的试验猪(P<0.05);90、100、115日龄,实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值极显著高于2次免疫的试验猪(P<0.01)。整个试验期,通过对国产和进口猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫效果的对比,发现试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著(P>0.05)。[结论]该免疫试验结果可为猪伪狂犬病免疫防控程序的应用提供依据。     

某规模化猪场猪伪狂犬gE和gB抗体的检测与分析

[目的]了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水平。[方法]采用ELISA法对2010~2013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1 217份进行猪伪狂犬野毒(gE)抗体和免疫(gB)抗体检测。[结果]种猪与育肥猪猪伪狂犬野毒总样品阳性率分别为13.5%和28.4%,其中60~100日龄的育肥猪总样品阳性率为5.2%,100~210日龄的总样品阳性率为42.1%;种猪伪狂犬免疫抗体总样品阳性率分别为92.2%,60~160日龄的育肥猪猪伪狂犬免疫抗体阳性率呈波动变化,血清样品总阳性率为50%。[结论]该猪场育肥猪群野毒感染率较种猪群高,且100日龄以后的育肥猪群野毒感染率较高,种猪群的免疫抗体水平高于育肥猪群,80~130日龄育肥猪免疫抗体水平较低。     

两种检测猪伪狂犬病gB抗体方法比较

为评价化学发光免疫分析法在临床检测猪伪狂犬病gB抗体中的适用性,将其与IDEXX公司ELISA抗体检测方法进行比对试验.对110份猪血清进行猪伪狂犬病gB抗体化学发光免疫分析法与ELISA法的检测.结果显示,以ELISA法为标准,化学发光免疫分析法检测猪伪狂犬病gB抗体的灵敏度、特异性、符合率分别为98.31%、100%、99.10%,Kappa=0.96,说明化学发光免疫分析法与ELISA法的符合率较高,且其操作步骤更简便,更省时,可以用于临床猪血清样品的猪伪狂犬病gB抗体的检测.     

黑龙江省某规模化猪场伪狂犬病病毒gE和gB抗体的检测与分析

为调查黑龙江省某规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫情况,运用酶联免疫吸附试验(ELISA)对今年4月份和7月份随机采集于该场的395份血清样本进行猪伪狂犬病病毒gE和gB抗体检测.结果表明:该规模化猪场两次猪伪狂犬病病毒gE抗体检测阳性率均为0,说明猪场现阶段不存在猪伪狂犬病野毒感染;两次检测基础猪群伪狂犬病病毒g...     

猪伪狂犬病病毒粤A株的分离与鉴定

从广东番禺某猪场病死仔猪中分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）毒株,通过对其理化特性的鉴定,中和试验,实验动物回归试验,电镜观察,ＰＣＲ扩增及感染力测定,发现其对氯仿、乙醚均敏感,能中和Ｐｒ不标准阳性血清,实验兔接种该病毒后,发生瘙痒并麻痹致死,电中见病毒粒子呈示规则圆形并带有囊和纤窝。ＰＣＲ体外扩增可见其不Ａ株在同一水平位置上有相同的电泳带,用Ｍａｒｃ１４５测定其毒为１０＾７．５ＴＣＩＤ５０／     

猪伪狂犬病毒YZ株gE全基因的克隆与序列分析

为了解猪伪狂犬病毒(PRV)g E基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV g E全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了g E全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株g E基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株g E全基因序列由1 862bp组成,与Gen Bank已发表的13株PRV g E参考株序列同源性介于97.9%~99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。     

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建

根据伪狂犬病毒(PRV)NLA-3和Rice株的gE基因序列，设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BarnHI酶切位点的引物，以PRV粤A毒株（PRV-YA)基因组为模板，利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段，将这一片段克隆至PMDl8-T载体中，获得重组质粒PMID18-gE；用HindⅢ和BarnHI酶切该重组质粒，回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因，将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3．1( )真核表达载体中，获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-gE，经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

PRV gE抗原表位基因的序列分析

设计，合成了1对特异笥引物，以PRV－MinA和PRV－YueA株的病毒基因组为模板扩增gE的抗原表位基因，均获得了约560bp的特异性产物，将PCR产物克隆到pUCm-T载体上，构建重组质粒pUCMAgE和pUCYAgE。经菌落PCR和质粒酶切鉴定后，将目的基因进行序列测定。结果表明：目的基因均为558bp组成，编码186个氨基酸；核酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分析表明，PRV－YueA和PRV－MinA株具有相对较低的同一性，分别为96．9％和92．5％。     

鸡传染性喉气管炎病毒长葛株gE全基因的克隆与序列分析

[目的]防治鸡传染性喉气管炎,减少该病对养鸡业造成的损失。[方法]参考GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gE基因序列设计并合成1对引物,以ILTV河南长葛株DNA为模板,PCR扩增出一条1 550 bp的特异性条带,并克隆至pGEM-T载体上。经PCR扩增、酶切鉴定,得到含gE基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定。[结果]与GenBank收录的传染性喉气管炎病毒gE基因和其他部分疱疹病毒gE基因序列进行比较,发现传染性喉气管炎病毒间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.9%、99.8%;与其他动物疱疹病(MDV、CHV、PRV、EHV的gE基因)毒核苷酸的同源性分别为25.6%、23.9%、28.3%、26.1%。[结论]不同ILTV毒株之间gE基因差异甚小,gE基因比较保守,但与其他动物疱疹病(MDV、CHV、PRV、EHV的gE基因)毒核苷酸的同源性较低。该研究为gE基因的功能研究提供了依据。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用 Vero 细胞从疑似伪狂犬病病毒（PRV）引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株 gE基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株 PRV 毒株,命名为 PRV N5B 株,该病毒能在 Vero 细胞上增值,在15代 TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;gE基因全长1740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%～100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒（106/0.1 ml）滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的 PRV N5B分离株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

猪伪狂犬病毒gB基因序列分析

2011年以来我国多省免疫猪伪狂犬病毒gE基因缺失苗猪场出现变异型猪伪狂犬病毒(PRV)感染,经典猪伪狂犬病毒疫苗(Bartha-k61)对该病无法提供100%有效保护,已有研究发现变异型PRV和经典PRV gE基因存在特征性变异。为明确变异型PRVgB基因特征,本研究对GenBank中登录的部分PRV代表株gB基因进行分析比较。结果表明,我国经典型和变异型PRV在gB蛋白氨基酸编码区第395位、453位、562位和739位存在特征性差异,但不同来源PRVgB基因的核苷酸和氨基酸同源性分别在98.1%~100%和96.1%~100%。从相互之间的遗传进化关系可以看出,PRV遗传进化出现两个大的遗传分支,呈现明显的地域性。新发变异型和经典型PRV在中国PRV遗传进化分支上呈现各自独立进化小分支;我国近年分离的貉源和约克夏梗犬源与新发变异型PRV则处于同一进化小分支。     

传染性喉气管炎病毒烟台株gE基因的克隆与序列分析

根据传染性喉气管炎病毒(ILTV)gE基因序列设计并合成1对引物,以烟台株为模板,用PCR法扩增出1条1.5kb的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体中。经电泳分析、酶切鉴定,将得到的重组质粒命名为pMD-gE并进行序列测定。将测序结果与ILTV美国标准攻毒毒株和中国王岗株,BHV-1,EHV-1,FHV-1,HHV-2,HHV-3,HVT,MDV-1,MDV-2,PRV的gE基因比较,发现核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.7%~11.9%和99.4%~15%。结果表明,不同ILTV毒株之间gE基因还是比较保守的,但不同疱疹病毒之间,gE基因的同源性较低。     

伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定

以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株（PRV YA）的基因组为模板，利用聚合酶链反应（PCR）扩增TK基因，获得预定大小的片段，将这一自然克隆到PMD18－T载体中。对重组质粒PMD18－TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒（PRV）Ea株UL49.5基因片段为探针，同SalI、KpnI、BamHI消化的PRV Ea株基因组DNA进行Southern杂交，确定SalI2.8kb、KpnI17.0kb、BamHI25.0kb片段中含UL49基因。将SalI2.8kb片段克隆到pUC119中，利用其中的BamHI进行亚克隆，获得重组质粒pUC2.0。测定约2.0kb片段的全序列并进行序列分析，发现该片段包含UL50基因部分编码区，UL49.5基因和UL49基因的完整编码区，并且在UL49基因下游，还存在一段约369个碱基的序列，经与人单纯疱疹病毒I型（HSV－1）、牛单纯疱疹病毒I型（BHV－1）的UL48基因进行比对，具有较高的同源性，推测为PRV UL48基因的部分编码区。