常规和巢式PCR对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度比较

根据柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)病菌16SrDNA、16S/23S核糖体基因间隔区(ribosomal intergenic region,RIR)、核糖体蛋白β操纵子(β-operon)和外膜蛋白(out membrane protein,OMP)基因序列设计了8对引物,通过常规和巢式PCR方法对各引物的检测灵敏度进行了比较。结果表明,不同引物的检测灵敏度不同。对于上述任何基因,巢式PCR的灵敏度均比常规PCR至少高103倍;对于同一种基因,扩增短片段的引物比扩增长片段的引物灵敏度高或相当;在扩增产物大小相同时,用以扩增核糖体蛋白β操纵子基因的引物较其他三种稍高。对不同症状柑橘样品的检测进一步验证了该结果。因此,对于柑橘黄龙病的检测,可优先考虑使用巢式PCR方法,若使用常规PCR,则宜选用具有高灵敏度的扩增小片段引物。     

转基因抗草丁膦油菜籽中B arnase基因 的实时荧光定量PCR检测

利用荧光定量PCR技术,对进口抗草丁膦油菜籽中的B arnase基因进行了定量检测,分别建立了抗草丁 膦油菜籽参照样品外源B arnase基因和内标准HMG基因Ct值与模板量之间的标准曲线和线性回归方程,运用所 建立起来的方法对14批油菜籽样品进行了定量分析。 转基因油菜籽; 草丁膦; B arnase基因; HMG基因; 定量PCR     

转基因抗草丁膦油菜籽检测方法研究

应用PCR技术，测试抗草丁膦杂交油菜籽中转入的外源抗草丁膦除草剂基因（BAR）、雄性不育基因（BARNASE）和恢复基因（BARSTAR），通过对PCR产物进行克隆和测序，建立了检测转基因抗草丁膦油菜籽的技术和方法。     

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。     

转基因小麦的定性PCR筛选检测技术

为了建立转基因小麦的PCR检测方法标准,以B73、B72、B102三个被转入外源高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的转基因小麦品系为材料,对目前国内外转基因小麦中通用的标记基因bar和uidA、NOS终止子和Ubiquitin启动子进行了定性PCR的筛选检测,在国内外首次找到了小麦中特有的内参照基因麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成了麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D)和Ubiquitin启动子的引物序列,并对PCR反应条件进行了优化,PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,可以检测到预期大小的目的片段.同时对PCR产物用实时荧光定量PCR进行了确证实验,并得到预期的结果.定性PCR最低检测灵敏度为0.5%(w/w).建立的转基因小麦定性PCR筛选检测方法具有通用性.     

抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究

根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测

由可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引致的溃疡病是目前威胁南洋楹健康生产和品质的重要病害。快速、准确检测病原菌是进行病害有效防控的基础。本研究用南洋楹溃疡病菌翻译延伸因子（EF 1-α）编码基因上保守靶基因区域的序列设计特异性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α编码基因通用引物EF-688F/986R和特异性引物EF-AF/AR组合进行巢式PCR扩增,获得264 bp的单一条带,灵敏度检测最低限度为1 fg/μL。利用建立的巢式PCR方法对林间疑似溃疡病的病样进行检测,能够特异性地检测到L. theobromae。本研究建立的巢式PCR检测方法准确、特异且灵敏性高,可为南洋楹溃疡病的早期诊断和及时防控提供基础的理论和实践依据。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。     

转基因油菜RF1的外源基因插入位点分析与事件特异性检测方法研究

采用基因组步移和巢式PCR方法研究了转基因油菜雄性不育恢复系RF1外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了RF1转化事件特异性检测方法。从RF1基因组DNA中分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列798bp,包括335bp的插入载体序列和463bp的旁侧基因组序列。根据已发表的RF1右边界旁侧序列的信息,发现外源T-DNA在向油菜基因组整合的过程中,在整合位点处有75bp的基因组序列丢失。根据分离的RF1左边界旁侧序列,建立了RF1事件特异性定性检测方法,扩增片断大小为284bp。利用建立起来的RF1事件特异性定性检测方法可以准确的将转基因油菜RF1与其它的转基因油菜品种区分开,检测灵敏度达到5个拷贝（0.013%）。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因油菜品种RF1的身份识别提供了有效的方法。     

转基因油菜抗旱、抗寒及休眠能力的比较

以3个转基因油菜品系及3个对照品种为材料，在大田条件下比较研究了转基因油菜与非转基因对照苗期的抗旱能力、抗寒能力及其种子在大田土壤中的休眠能力，结果表明转基因油菜与非转基因对照苗期都有较好的抗旱能力、抗寒能力，两者之间无显著性差异。在埋入土壤表层（3 cm）与深层（20 cm）条件下，转基因与非转基因对照种子之间的萌发率差异均不显著。     

中国栽培油菜的起源和进化

在分析中国栽培油菜主要性状进化趋势的基础上，对中国栽培油菜的分类系统进行了补充完善。并通过油菜野生种分布、特有类型和原始类型分布、外类群分布、古代文化遗址考古及古代文献考证和地质与气候背景资料分析，提出以青藏高原为主体的西部高山、丘陵地区是我国栽培白菜型和芥菜型油菜的起源地，并提出了芥菜型油菜起源与进化的另一条路径，即芥菜型油菜可能是由新疆毛芥染色体加倍演化而来的观点。     

北方白菜型冬油菜BrFLC家族的全基因组鉴定、克隆及表达分析

春化过程是冬性植物抽薹开花前的主要阶段。FLC（FLOWERING LOCUS C）基因在春化过程中可以整合上游信号调控植物开花。为了解白菜型冬油菜中FLC基因的特征及其春化功能,以6个拟南芥FLC基因为索引从白菜型冬油菜基因组中鉴定得到10个BrFLC基因,其中8个均含有7个外显子。10个BrFLC分布于4条染色体上,存在明显的基因复制现象。进化及保守结构分析显示聚为一类的成员蛋白质保守Motif分布相似。基因上游1500 bp的启动子区域均含有光应答元件,其中BrFLC4、BrFLC5和BrFLC6含低温响应元件,BrFLC3、BrFLC4、BrFLC7、BrFLC9含激素响应元件。比对发现,位于A02上的BrFLC6基因序列与大白菜中已注释的Bra031886差异性较大。克隆到陇油6号、陇油17、天油2号和天祝小油菜中的BrFLC6基因,序列相似性达99.5%。分析其中序列差异最大的BrFLC6基因,qRT-PCR检测发现它可在根、茎、叶、花蕾及花中表达;春化处理后则表达下调,不同品种间下调幅度有差异。结合春化率的观察,认为春化过程抑制了BrFLC6的表达,且基因表达水平与白菜型冬油菜通过春化所需的时间有关。     

油菜籽粒千粒重图像测定方法

为快速、自动、精准地测定油菜籽粒千粒重,建立一种基于图像处理技术,对不同品种的甘蓝型油菜籽粒进行分样、称取质量、获取图像并经图像处理得到表征籽粒面积的像素数,建立籽粒面积与质量之间的相关性模型.利用选择性极限腐蚀算法获得每个籽粒的核,并标记在籽粒的梯度图像上,再利用分水岭算法对标记的梯度图像进行分割.提取一次分割后仍然...     

油菜籽叶绿素含量近红外光谱快速检测

        油菜机械化收获的油菜籽叶绿素含量不一致，直接影响其加工成本和菜籽油品质，亟需建立成熟期油菜籽中叶绿素快速无损检测技术。本文采用紫外可见分光光度法测定450份代表性油菜籽样品中叶绿素含量，并采集近红外光谱数据。通过一阶导数、标准正态变量变换预处理，采用竞争性自适应重加权采样算法进行波长选择，建立了油菜籽中叶绿素含量偏最小二乘法回归模型。交互检验结果显示，油菜籽中叶绿素含量预测模型的验证集决定系数为0.9446，交叉检验均方根误差(RMSECV)为1.36mg/kg。研究表明，该方法可以准确预测油菜籽中叶绿素含量，为油菜籽品质快速监测提供了重要的技术支撑。     

贮藏时间对油菜种子生理生化性状的影响

本文以贮藏在常温密封干燥条件下的油菜种子为材料,研究与种子活力有关的理化特性。结果表明,油菜种子活力与电导率呈负相关;活力较低的种子可溶性糖和蛋白质的外渗量明显增加,超氧化物岐化酶、过氧化氢酶活性以及维生素C含量明显下降。     

不同油菜品种种子带菌检测

以油菜主产区的10个主栽品种的种子为材料,将吸水纸检测法与分子指纹分析相结合,对种子携带的真菌进行分离和鉴定。结果表明,供试油菜种子携带有7属9种真菌,其优势菌群为镰刀菌属（Fusarium sp.）、链格孢属 （Alternaria sp.）以及青霉属（Penicillium sp.）,且不同油菜品种之间种子所携带的真菌种类有较大差异。     

干燥器保存油菜种子的遗传稳定性研究

贮藏于密封干燥器中的油菜种子活力、田间植株生长发育节律和形态及农艺性状的研究结果表明，保存时间超过１１ａ，种子含水量可降至４％以下。于燥器中保存１１ａ的种子产生的变异为可逆的生理性变化，保存时间超过１８ａ则发生不可逆的遗传性劣变。初步确认利用密封干燥器和适宜干燥剂能安全保存油菜种子１０ａ左右。     

CaCl_2溶液处理油菜种子的萌发代谢效应

油菜种子秦油2号分别用不同浓度的CaCl_2及不同时间浸种处理。结果表明,在一定浓度和时间范围内,Ca~(2 )能够促进脂肪酶、过氧化物酶的活力、加强呼吸,提高发芽率。用0.3％CaCl_2溶液浸种24小时效果最佳。浸种时间过长和浓度过高,对油菜种子萌发及代谢有抑制作用。