大豆Glyma.05G222700.2基因生物信息学与逆境表达分析

为研究Glyma.05G222700.2基因编码的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在抗非生物胁迫过程的功能和原理,促进大豆抗逆候选基因的开发利用,本研究通过生物信息学方法对大豆Glyma.05G222700.2基因进行同源序列、蛋白结构、进化树和转录组分析,通过qRT-PCR分析盐胁迫下大豆不同组织中该基因的表达情况。结果表明:该基因编码区长2 040 bp,编码697个氨基酸,预测分子量为656.54 kD,pI8.026。多序列比对发现Glyma.05G222700.2蛋白包含1个Pkinase结构域。进化树分析表明该蛋白与野大豆、刺毛黧豆、赤豆一致性较高。转录组数据表明Glyma.05G222700.2基因在大豆各组织中均有表达,其中在种子中表达量最高,在根中表达量最低。qRT-PCR结果发现Glyma.05G222700.2基因在毛状根、茎、叶中均有表达,在茎中表达量最高,在叶中表达量最低;在毛状根中盐胁迫12 h表达量达到极值,盐胁迫24 h表达量下降;在茎中表达量呈上升趋势,在24 h表达量达到极值;在叶中表达量不稳定,盐胁迫2 h该基因不表达,盐胁迫6 h该基因表达量达到极值并高于...     

大豆Glyma.18G261700基因生物学分析及功能初探

MYB是参与花青素合成的重要调控基因,数量众多且功能多样。为分析大豆中与花生黑色种皮调控基因AhTc1(MYB家族)同源基因的功能,本研究根据AhTc1基因序列信息,同源克隆大豆MYB家族基因Glyma.18G261700,对其进行生物信息学分析,并检测不同种皮颜色大豆苗期不同部位花青素和基因表达量。结果显示：Glyma.18G261700全长1 572 bp,编码189个氨基酸,属于R2R3型MYB。AhTc1编码的蛋白为疏水性蛋白,而Glyma.18G261700与之不同,编码的蛋白为亲水性蛋白。三级结构中Glyma.18G261700与AhTc1尾部有所区别,在调控种皮颜色中可能具有不同功能。不同种皮颜色大豆幼苗根部花青素含量较低,而Glyma.18G261700基因的表达量较高,表明在大豆幼苗期该基因的大量表达可能抑制根部花青素的合成,但对种皮颜色的调控还需进一步探索。     

大豆Glyma04G227700生物信息学分析及与Glyma08G11030互作研究

咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase, COMT)是一种催化苯丙素类化合物羟基上氧原子的甲基化酶。前期研究表明,大豆抵御干旱胁迫的F-box基因Glyma08G11030编码蛋白可能与COMT蛋白Glyma04G227700发生互作,为了预测分析大豆COMT基因Glyma04G227700的功能及二者的互作关系,本研究克隆Glyma04G227700基因,并对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量检测方法分析其在大豆不同组织中的表达情况,并利用酵母双杂交系统验证蛋白互作情况。结果显示：Glyma04G227700基因全长1 095 bp,编码366个氨基酸,与野大豆(RZC17879.1 Glycine soja)亲缘关系较近。Glyma04G227700在大豆的根、茎、叶、子叶中都有表达,且在根和茎中表达量较高,在子叶中表达量最低。酵母双杂结果表明Glyma08G11030与Glyma04G227700蛋白不存在互作。     

小白菜RING锌指蛋白基因的克隆及其表达分析

锌指蛋白在调控植物防御和抗性方面具有重要作用。根据从小白菜中获得的与铜胁迫相关的RING锌指蛋白基因TDF片段设计引物,应用RACE技术克隆出具有完整阅读框的小白菜RING锌指蛋白基因,该基因全长855 bp,开放阅读框606 bp,编码202个氨基酸,分子量为21.32 ku,理论等电点为6.87,属于中性蛋白。结构分析结果表明,该蛋白C-端含有1个保守的C3HC4型RING锌指结构域。进化树分析结果显示,小白菜RING锌指蛋白与芜菁RING锌指蛋白的相似度高达98%,属于C3HC4型RING锌指亚家族。RT-PCR分析结果表明,在铜胁迫下该基因下调表达,推测其可能参与对铜胁迫的应答反应。此结果为进一步研究该基因在小白菜逆境应答中的作用机制奠定基础。     

大豆硫氧还蛋白基因的克隆与分析

通过对大豆耐盐品种文丰7盐处理抑制差减文库的筛选,获得了一些差异表 达的EST序列,与NCBI中EST数据库进行比对分析后发现,其中1个与硫氧还蛋白相关.据此预测了大豆硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)基因的cDNA序列,并采用RT-PCR方法克隆了大豆Trx基因.生物信息学分析表明:该基因包含1个354 b...     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

大豆生态研究 Ⅲ 野生大豆(G. soja)与栽培大豆(G. max)光周期效应的比较研究

通过长日照(18小时)短日照(8小时)方法,比较研究相同原产地(25°44′N)野生大豆与栽培大豆的光周期效应。(1)大豆出苗8天内即有明显光周期效应,(2)在短日照下,野生大豆光照阶段长度9—12天,栽培大豆3—6天,野生大豆从出苗到0.9复叶,栽培大豆从出苗到真叶期间通过光照阶段。(3)大豆光周期效应不仅制约开花,且制约能否结荚与成熟,(4)讨论了由野生大豆进化为栽培大豆光周期效应特性的变化趋向。另外,野生大豆光周期效应的强度,低纬度的高于高纬度的,同纬度低海拔的高于高海拔的。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

晋麦47幼苗中一个水分胁迫应答蛋白的SDS-PAGE和Nano LC-MS/MS鉴定

水分胁迫应答蛋白的表达与小麦品种的抗旱性密切相关。为了明确与抗旱相关的水分胁迫D-应答蛋白的表达特点及蛋白组成,对小麦品种晋麦47幼苗进行不同供水量处理,应用SDS-PAGE、纳升级液相色谱-电喷雾串联质谱联用技术(Nano LC-MS/MS),分析了水分胁迫D-应答蛋白条带表达量的变化和蛋白组成。SDS-PAGE检测结果表明,水分胁迫D-应答蛋白条带在-0.5 MPa PEG-6000水溶液胁迫下,6 h出现可见表达,胁迫至48 h时表达量最大,之后,此蛋白条带的表达量又逐渐下降;幼苗胁迫48 h后恢复正常供水,复水72 h后该蛋白消失。切取正常供水和胁迫处理两个条件下SDS-PAGE胶差异表达蛋白条带,经质谱分析分别获得两个阳性结果,且正常供水和PEG-6000胁迫两种处理条件下D-应答蛋白组成一致,均由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基和磷酸甘油酸变位酶组成(P<0.05);PEG-6000胁迫条件下两个蛋白(亚基)的鉴定得分分别为1 632和88,覆盖率分别为30%和21%;在鉴定的肽段中,有65个肽段同属于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基,其中35个肽段可信度均超过阈值分数;有5个肽段同属于磷酸甘油酸变位酶,其中4个肽段的可信度超过阈值分数。结果表明该蛋白条带可能主要由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基等组成。     

大豆转录因子GmbZIP60对非生物胁迫的表达模式分析

bZIP基因在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要的调控作用。前期试验已经从大豆中克隆到一个bZIP基因GmbZIO60(Genebank Accession No:DQ787038),并成功转化到拟南芥中。本研究在此基础上,利用qRT-PCR和GUS组织化学染色法研究了高温(37℃)、低温(4℃)、干旱(PEG6000)、NaCl(200 mmol·L~(-1))和ABA(100 mg·L~(-1))处理对GmbZIP60卻表达的影响。结果表明:髙温、低温、干旱和NaCl胁迫处理下,CznbZIP60表达量显著降低,分别变为对照组的0.07,0.25,0.36和0.13倍,而ABA处理对GmbZIP60表达量影响不显著,GUS染色结果与荧光定量PCR结果一致。研究认为,GmbZIP60可能以负调控的方式参与大豆抗高盐、干旱、高温、低温等非生物胁迫的应答反应。本研究为进一步鉴定和克隆大豆逆境应答关键基因、揭示大豆抗逆分子机制和大豆抗逆性基因工程改良提供了有益借鉴。     

大豆SbPRP1和SbPRP2基因在非生物胁迫下的表达及载体构建

为研究大豆细胞壁脯氨酸富集蛋白基因在非生物胁迫下发挥的作用,利用实时荧光定量PCR,对大豆中的两个脯氨酸富集蛋白基因SbPRP1和SbPRP2在非生物胁迫下的表达情况进行检测。结果显示:SbPRP1在高盐和低温处理下表达量下降,分别在处理后1和24 h达到最低值;在模拟干旱处理下表达量先下降后升高,处理后24 h达到最大值。SbPRP2在高盐、模拟干旱和低温处理下表达量均有所升高,分别在处理后24,1和5 h达到最大值。表明SbPRP1和SbPRP2可能参与了大豆对不利环境的适应性调控。通过RT-PCR从大豆叶片中扩增SbPRP1和SbPRP2的基因全序列并构建到植物表达载体pRI101-AN上。     

大豆RNA依赖的RNA聚合酶基因GmRDR1的克隆与表达特性分析

为了寻找大豆抗病新基因,培育大豆新型抗性品种,利用同源克隆的方法从大豆品种科丰1号中分离出1个新的GmRDR1基因,并对其进行序列分析,组织表达、抗逆境胁迫表达分析及该基因的亚细胞定位研究。结果表明:GmRDR1基因位于大豆基因组的第2号染色体,基因全长为3 956 bp,其中ORF为3 378 bp,编码1 125个氨基酸,相对分子量和等电点分别为279.72×103和4.63;GmRDR1含有RDRs家族的保守序列"DLDGD";该基因在所有被检测组织中均表达,并且在叶中的表达量最高;荧光定量结果发现:在大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)处理下,GmRDR1在抗病材料科丰1号中的表达量显著高于感病材料南农1138-2。盐及干旱胁迫下,48 h之内,该基因的表达量明显升高,SA诱导条件下该基因在6 h出现了早期响应,冷害处理下24 h表达量出现了突然的升高。GmRDR1基因的亚细胞定位结果表明:该基因所编码的蛋白定位在细胞核里。根据以上结果判定GmRDR1基因参与了大豆对SMV的抗性反应,并且能够强烈响应盐和干旱的胁迫,因此该基因在大豆抗逆分子育种中具有较好的应用价值。     

大豆GmPic基因的分离及表达分析

对光敏感型大豆品种“中豆24”进行长日、短日和自然光3种光周期处理,采用cDNA-AFLP的方法筛选差异片段,并进一步通过RACE技术分离了该基因。该基因全长983 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码248个氨基酸,在遗传关系上与线粒体磷酸盐转运蛋白高度同源。通过半定量RT-PCR对该基因在不同光周期中的表达模式进行分析,结果表明,该基因在大豆生长发育的早期阶段表达,短日照抑制其表达,而长日照则增强其表达。因此,大豆线粒体磷酸盐转运蛋白基因可能是作为一种负调控因子参与大豆光周期反应。对大豆线粒体磷酸盐转运蛋白基因的研究能为进一步阐明大豆光周期反应分子机理打下基础。     

花生MAPK13基因的克隆及表达分析研究

为了挖掘花生抗果腐病相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,从花生果腐病转录组文库中筛选出促丝裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)基因编码区序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMAPK 13基因°结果表明AhMAPK 13基因序列全长1818 bp,含有/非编码区593 bp,5非编码区122 bp,开放阅读框全长1104 bp,编码1条含有368个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为42. 5kDa,含有MAPK家族典型的11个结构域,属于MAPK基因家族B组成员。亚细胞定位显示AhMAPK13定位于细胞质和细胞核中° RT-qPCR分析发现AhMAPK 13基因在茎中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMAPK 13基因受干旱、低温、NaCl(ABA诱导时表达量上升,说明该基因可能广泛参与植物非生物胁迫响应过程;AhMAPK 13基因受JA、GA、ET、SA诱导时表达量上调,说明该基因可能参与到这些激素介导的抗逆信号转导途径。本研究结果为花生抗果腐病育种研究提供了新的基因资源。     

一个水稻钙调素结合蛋白基因OsCaMBP的克隆及表达分析

 通过荧光差异显示和RT PCR技术,克隆到一个新的水稻钙调素结合蛋白基因OsCaMBP。序列分析表明,该基因cDNA序列全长2094 bp,编码一个具有569个氨基酸残基的多肽,推测分子量为63.2 kD;在OsCaMBP蛋白的N端存在IQ钙调素结合构象,与其他植物中的钙调素结合蛋白的相似性介于38.25%~47.28%。在热激处理15 min、30 min、 1 h或2 h后,该基因在水稻的叶、根和叶鞘中表达量急剧增加;此外,该基因表达量也受低温调控而增加。     

巴西橡胶树中2个NADP-苹果酸酶基因的克隆和表达特性分析

从橡胶树中克隆2个NADP-ME(苹果酸酶)基因的全长cDNA,分别命名为HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全长分别为2 428、2 139 bp,分别编码643、593个氨基酸组成的蛋白,二者的氨基酸序列一致性高达87.25%,且分别与蓖麻和杨树的一个NADP-ME序列具有较高的序列一致性。2个HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守结构域,均富含亮氨酸(Leu),同属于非分泌型稳定蛋白。2个HbNADP-ME基因在橡胶树不同组织中的表达存在明显差异,在根中的表达量最高,种子和花中的表达量次之;另外,HbNADP-ME1基因在胶乳中受机械伤害有下调表达趋势,HbNADP-ME2基因在胶乳中受割胶处理也表现出下调表达趋势,而低温胁迫则显著诱导2个基因在叶片和根中的表达。结果说明,HbNADP-ME基因可能参与橡胶树的抗逆应答及代谢调控(包括胶乳代谢调控)。此结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3’-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。     

番木瓜NAC转录因子的克隆与表达分析

为探究番木瓜NAC转录因子的序列特征及功能,以‘大庆7号’番木瓜果肉为试验材料,采用RTPCR克隆出2个不同的NAC类基因,命名为CpNAC1(Gene Bank KT364871)和CpNAC2(Gene Bank KT372241),其开放阅读框(ORF)长度分别为609 bp和805 bp,分别编码202个和268个氨基酸,其N端含有NAM保守结构域。采用实时荧光定量PCR研究其在乙烯利及清水对照处理后果实不同成熟时期中的表达情况,结果发现,CpNAC1和CpNAC2基因随着处理后时间的增加,表达量呈先下降后缓慢上升的趋势,且均与果实成熟呈负相关。但CpNAC1表达趋势与果实成熟过程中乙烯的表达量相反,受乙烯抑制降低表达量,从而参与了番木瓜果实的成熟衰老进程,而CpNAC2基因在乙烯处理后番木瓜果实中表达量与对照处理相比没有显著变化,说明CpNAC2基因不是通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟。