草鱼肠道组织抑制性消减表达序列标签的初步分析

以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因.     

棉花蕾铃离层脱落相关基因的克隆及其表达分析

[目的]研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,为解析离层脱落相关基因的表达、调控及功能鉴定提供基础资料.[方法]以50 mg/L赤霉素(GA3)和250 mg/L乙烯利(CEPA)分别处理的棉花蕾铃离层cDNA为Tester,H2O处理的棉花蕾铃离层cDNA为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建经GA3和乙烯处理后的消减文库,反向Northern blo-tting筛选出离层差异表达的EST序列,然后进行基因功能注释与功能分类,并分析蕾铃离层差异表达基因的组织表达模式和GA3诱导表达规律.[结果]以GA3处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为GA文库;以CEPA处理的离层cDNA为Tester、H2O处理的离层cDNA为Driver,所构建的cDNA文库命名为CE文库.从构建的两个消减文库(GA和CE)中共筛选出29个在离层差异表达的EST序列,通过基因功能注释与功能分类,可将这些EST序列分为翻译相关、代谢相关、信号传导、转录相关、蛋白合成、能量代谢、抗逆相关、基因组序列和未知功能等九大类,其中与翻译相关的EST序列占24.14%,说明经激素处理后棉花蕾铃离层有大量的蛋白合成.从消减文库中挑选10个差异表达基因(EST序列)进行RT-PCR分析,结果发现以GA3处理棉花蕾铃离层后部分相关基因的表达模式会发生变化.[结论]棉花蕾铃离层经激素处理后能激活脱落相关基因的表达,进而影响器官脱落,是其对逆境胁迫反应的结果.     

白粉菌诱导的中国野生毛葡萄抑制消减文库构建及EST序列分析

【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。     

巨型艾美球虫株间差异表达基因消减文库的构建和分析

为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础.     

应用抑制消减杂交技术克隆鼻咽癌转移调控基因

目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。     

镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库的构建和分析

【目的】寻找镰形扇头蜱吸血后较吸血前唾液腺差异表达基因。【方法】以抑制消减杂交法分别构建镰形扇头蜱半饱血雌蜱和吸血雄蜱唾液腺以pGEM-T-easy为载体的cDNA文库，并测序进行生物信息学分析。【结果】分别测得247个雌蜱有效EST序列和168个雄蜱有效EST序列，并预测雌蜱可能含有5′末端和3′末端的EST序列分别为25个和44个，雄蜱可能含有5′末端和3′末端EST序列分别为53个和74个。随机选择非重复的24个雌蜱序列和21个雄蜱序列以RT-PCR方法验证消减效果；在吸血后唾液腺中，雌蜱有13个基因表达上调或新表达，消减效率为54%，雄蜱有9个基因表达上调或新表达，消减效率为43%。对所测有效序列经BLAST分析，检索247个雌蜱序列获得141个匹配，匹配率为57%，其中有32个蜱基因，占141个匹配基因的23%；检索168个雄蜱序列获得125个匹配，匹配率为74%，其中有29个蜱基因，占125个匹配基因的23%。BLAST检索结果显示这些蛋白主要包括帮助蜱口器固定免疫调节蛋白、抗凝血蛋白、加强能量代谢的线粒体蛋白和促进基因转录的各种转录因子。【结论】这些蛋白主要是为了适应蜱吸血的生理过程及应变蜱因吸血而产生的免疫防御和排斥。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

绒山羊胚胎期和兴盛期皮肤毛囊差异表达基因研究

应用抑制性消减杂交技术成功构建了内蒙古绒山羊胚胎期和兴盛期皮肤毛囊的消减cDNA文库.从两个文库中分别随机挑取50个克隆测序分析,测序结果经Genbank同源性比对.表明在胚胎期消减cDNA文库中得到15个特异表达基因片段,包含1个未知新序列;在兴盛期消减cDNA文库中得到19个特异表达基因片段.包含2个未知新序列.     

多花水仙花瓣抑制消减杂交cDNA文库的构建及分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术,以多花水仙的栽培品种‘黄花水仙2号’黄色花瓣和‘金盏银台’白色花瓣的cDNA分别作为测试子和驱动子,建立正、反向抑制消减杂交cDNA文库.随机挑选正、反向文库各216个阳性克隆测序,对已知功能的uniESTs进行基因本体论(GO)分类分析,荧光定量PCR检测部分可能参与色素形成的uniESTs.结果表明:水仙花色差异表达正、反向消减文库经检验质量可靠,为分离花色形成相关基因奠定了基础;GO功能分类分析显示,水仙花色差异可能受到多个代谢途径的影响;经初步筛选得到11个与水仙花色形成相关的uniESTs,为进一步克隆基因全长和功能验证提供参考.     

Construction of a Full-Length cDNA Library of Gossypium hirsutum L.and Identification of Two MADS-Box Genes

A full-length normalized cDNA library for the flower development stages of short-season cotton(Gossypium hirsutum L.)(CCRI36)was constructed.A total of 3 421 clones were randomly selected for sequencing,with a total of 3 175 effective sequences obtained after removal of empty-carriers and low-quality sequences.Clustering the 3 175 high-quality expressed sequence tags(ESTs)resulted in a set of 2 906 non-redundant sequences comprised of 233 contigs and 2 673 singletons.Comparative analyses indicated that 913(43.6%)of the unigenes had homologues with function-known genes or functionassumed genes in the National Center for Biotechnology Information.In addition,763(36.4%)of the unigenes were functionally classified using Gene Ontology hierarchy.Through EST alignment and the screening method,the full-length cDNA of two MADS-box genes viz.,GhMADS11 and GhMADS12 were acquired.These genes may play a role in flower development,Phylogenetic analysis indicated that GhMADS11 and GhMADS12 had high homology and close evolutionary relationship with AGL2/SEP-type and PI-type genes,respectively.The expression of both GhMADS11 and GhMADS12,genes was high in reproductive organs.In floral organs,GhMADS11 expression was high in petals(whorl2)and ovules,while GhMADS12 expression was high in petals(whorl2)and stamens(whorl3).Results show that the EST strategy based on a normalized cDNA library is an effective method for gene identification.The study provides more insights for future molecular research on the regulation mechanism of cotton flower development.     

蝴蝶兰PhaSEP3基因的克隆及其在突变体中的表达

E类MADS-box是花器官发育分子模型中必不可少的基因,通过突变体研究其表达模式将为深入理解兰科植物花器官的分子机理与完善花发育调控理论提供依据。采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从蝴蝶兰花瓣中克隆了一个E类MADS-box基因PhaSEP3(GenBank登录号为MZ436812),并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5种突变体中的表达水平。结果表明,该基因cDNA全长为1 236 bp,具有753 bp的开放阅读框(ORF),可编码250个氨基酸,其C端具有SEPⅠ和SEPⅡ基序。系统进化分析显示,该基因编码蛋白质与蝴蝶兰属的PeSEP3和AGL9亲缘关系最近。组织特异表达分析表明,PhaSEP3基因主要在生殖器官和授粉后子房中表达;在不同突变体中,PhaSEP3基因在侧萼唇瓣化突变体的萼片和唇瓣中表达水平显著升高;在退化雄蕊瓣化突变体的侧瓣、唇瓣和子房中表达水平显著降低,在蕊柱中的表达水平显著升高;在侧瓣唇瓣化突变体的侧瓣和唇瓣中表达水平显著升高;在侧瓣退化突变体的侧瓣中表达水平显著降低,而在蕊柱和子房中表达水平显著升高;在侧瓣雄化突变体中,该基因的表达水平在萼片和侧瓣中均显著升高。分析认为,PhaSEP3基因主要调控蝴蝶兰花器官各轮组织与授粉后子房的发育,在突变体花器官中,PhaSEP3类基因可能与其他花发育基因互作参与花器官形态的发育调控。该研究结果为进一步理解兰科植物花器官多样性的调控机理提供了资料。     

毛白杨PtYABBY基因家族3个成员的克隆与表达分析

  目的  YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。  方法  以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。  结果  PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。  结论  YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。      

AP2基因在高等植物花器官发育中的作用概述

以植物花发育调控的分子模型为基础,介绍了花发育相关基因AP2在高等植物花器官和营养组织中的时空表达特点,以及参与花分生特性建立、花器官特性特化和形成调节、花同源异型基因活性时空调节等花发育过程;阐述了模式植物中与AP2基因一起参与花发育调控的其他基因,及其在基因调控网络中的关系。     

兰花MADS-box基因研究进展

MADS-box基因是一类非常重要的转录调控因子,在植物发育和信号传导中起着关键性作用。包括花器官发育基因,花分生组织特异性基因,促进开花的基因。研究表明,A类基因可能与花器官发育和控制开花有关;B类基因可能与花被片形态和结构特异有关,并且有些基因在营养器官中也有表达。     

薄壳山核桃MADS—box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS—box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT—PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS．box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65．7％-98．5％,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归人拟南芥MADS．box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS．box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

梅花 PmAP2基因的克隆及表达1）

为了解析梅花（Prunus mume Sieb．et Zucc．）花器官发育的分子调控机理,采用RT－PCR的方法从梅花‘三轮玉蝶’中克隆了APETALE2的同源基因PmAP2,并采用荧光定量PCR对PmAP 2的表达模式进行了分析。序列分析表明,PmAP2基因CDS区域全长1647 bp,编码548个氨基酸,含有两个保守的AP2结构域,属于AP2／ERF基因家族。多序列比对和系统进化结果显示,该基因与桃、苹果AP2基因相似性较高,分别为96％和82％。PmAP2在梅花营养器官、四轮花器官和果实中均有表达,花瓣中的表达量最高;台阁花型梅花花中PmAP2表达量最高,重瓣品种次之,单瓣品种表达量最低。 PmAP2的差异表达可能与梅花的花型进化有关。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

【目的】克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础。【方法】以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析。【结果】分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异。系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因。【结论】薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因。     

番茄长花柱品系T431低温胁迫下正向差减文库的构建及ESTs分析

本研究以番茄长花柱品系T431为材料利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了低温胁迫下的番茄长花柱突变体SSH cDNA正向差减文库,获得398个阳性克隆.经菌液PCR和Reverse Northern Blot杂交方法结合剔除假阳性,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对,获得有功能的ESTs 173个.通过对所获得的ESTs序列进行功能分类发现,其中参与初级代谢、能量代谢、抗病/防御反应和信号传导等过程的基因相对较多.此外,还有一些基因参与植物体内蛋白质合成与加工、物质运输、转运调控与生殖发育等过程.     

抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因

[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因。[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因。[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签（ESTs）。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高。该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础。