动物、环境及饲养员多重耐药大肠杆菌的PFGE分型研究

【目的】了解养殖场多重耐药大肠杆菌耐药性的传播机制，探讨人、动物与环境间耐药菌垂直克隆传播的可能性。【方法】采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法对分离自养殖场动物、环境和饲养员的86株耐药谱相近多重耐药大肠杆菌进行DNA指纹图谱分型，比较菌株之间的亲缘关系。【结果】37株鸡场来源大肠杆菌可分为20种PFGE分型；49株猪场来源大肠杆菌可分为24种PFGE分型；同一动物、环境或饲养员采样点分离菌株PFGE指纹图谱相同者较多；同一养殖场不同动物个体、养殖场环境不同采样点、动物和环境以及饲养员和环境都存在PFGE指纹图谱完全相同菌株；鸡场和猪场都发现有属同一PFGE分型的来自动物、饲养员和环境的菌株；86株菌全部对环丙沙星、氨苄西林、链霉素、四环素、多西环素和复方新诺明耐药，相同PFGE分型的菌株其耐药谱型不一定相同。【结论】养殖场动物、环境及饲养员之间存在多重耐药大肠杆菌的克隆传播。     

大麦高分子量基因组DNA提取的优化

高分子量(HMW)DNA的制备是进行生物基因组物理作图等相关基因组学研究至关重要的基础工作。为建立一种高效的提取大麦高分子量DNA的方法,对琼脂糖包埋原生质体和琼脂糖包埋细胞核分离基因组DNA的方法进行了改良和优化。限制酶消化,脉冲电场凝胶电泳(PFGE)和Southern杂交等检测表明,应用优化的实验方法所分离的大麦基因组HMW DNA质量好,数量多。与原方法相比,新改进的方法实验流程缩短,效率提高,所分离HMWDNA能更好地满足后续相关研究的需要。这两种优化的分离大麦HMW DNA技术亦可应用于其它禾谷类植物基因组DNA的制备。     

产单核细胞李斯特菌的脉冲场凝胶电泳分型方法研究

建立产单核细胞李斯特菌的脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法,对单核细胞李斯特菌的PFGE技术进行优化,以期获得条带亮度和清晰度都理想的脉冲图谱以及包含较多信息的分析结果;13株单核细胞李斯特菌经PFGE分析获得菌株的遗传进化树和相似性距阵.本研究建立的PFGE分型方法,为单核细胞李斯特菌的溯源追踪提供了很好的技术平台,对于其他革兰氏阳性菌PFGE分型方法的探索也具有重要的参考价值.     

稀有放线菌小单孢菌噬菌体ФHAU8溶源菌的分离与验证

用小单孢菌40027菌株作为指示菌,分离得到噬菌体ФHAU8的抗性菌株,通过高压脉冲电泳(PFGE)和Southern杂交试验表明:ФHAU8 DNA已整合到小单孢菌40027菌株染色体的500 kb的AseI片段中;该抗性菌株为噬菌体ФHAU8的溶源菌,命名为LXH8。     

稀有放线菌小单孢菌噬菌体ΦHAU8溶源菌的分离与验证

用小单孢菌40027菌株作为指示菌,分离得到噬菌体ΦHAU8的抗性菌株,通过高压脉冲电泳(PFGE)和Southern杂交试验表明:ΦHAU8 DNA已整合到小单孢菌40027菌株染色体的500 kb的AseⅠ片段中;该抗性菌株为噬菌体ΦHAU8的溶源菌,命名为LXH8.     

菖蒲芋螺不同大小基因组DNA片段的分离制备

使用常规酚/氯仿抽提法(CTAB法)、离心柱法和磁珠吸附法,分别从菖蒲芋螺毒腺、肌肉及肝胰脏中提取基因组DNA,利用普通琼脂糖凝胶电泳与脉冲场电泳(PFGE)对基因组DNA片段进行分离,并检测提取DNA的大小和分布范围,同时,对脉冲场电泳条件进行了优化。结果表明,3种方法均可提取基因组DNA,其中CTAB法和离心柱法提取的毒腺DNA纯度高,产率大,可用于后续实验,而磁珠法产率适中且纯度不高,但离心柱法的DNA片段较小,大多在9 kb以下,而CTAB法提取的DNA片段较大,获得的20 kb以上的大片段量较多,更适合于大片段基因组文库的构建。3种芋螺组织中,肝胰脏产率最高但片段弥散有降解,毒腺DNA片段较大且集中,产率也较高,而肌肉的DNA片段产率最低且片段较小。因此,用CTAB法提取菖蒲芋螺毒腺的DNA更适合构建大片段基因组DNA文库。筛选高质量的菖蒲芋螺的DNA,利用优化的脉冲场电泳条件进行分离回收,获得了不同大小片段的DNA,为后续菖蒲芋螺不同载体系统的基因组文库构建奠定了基础。     

食品中阪崎克罗诺杆菌的药物敏感性及分子分型研究

克罗诺杆菌是一种革兰氏阴性菌,是配方粉中威胁婴幼儿健康的主要致病菌。近年来,乳制品及食品中常有克罗诺杆菌耐药株的报道,耐药株的出现给临床治疗带来巨大挑战。为探究PFGE型别与耐药表型之间的关联性,采用BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定及药敏系统对食品分离的68株阪崎克罗诺杆菌进行药敏检测,共选择19种抗生素,并采用PFGE对其进行分子分型。结果表明：4株阪崎克罗诺杆菌具有耐药性,耐药率为5.88%。其中,3株对头孢唑啉耐药,1株对四环素耐药。18株菌表现为中介,其中16株对头孢唑啉中介,2株对氯霉素中介。所有菌株对其余16种抗生素均敏感。68株阪崎克罗诺杆菌可分成58个PFGE带型,其中PT037、PT050、PT054、PT007、PT043及PT046带型分别含有4、3、3、2、2、2株菌,其余52个带型各含1株菌,带型较分散。3株头孢唑啉耐药菌株包含3个PFGE带型,18株中介菌株包含16个PFGE带型。检测的阪崎克罗诺杆菌食品分离株耐药率较低,未发现多重耐药菌株,且呈现出高度基因多态性,菌株PFGE带型与耐药性之间无明显相关性。     

空肠弯曲杆菌多酶脉冲场电泳基因分型研究

为提高脉冲场电泳(PFGE)技术对空场弯曲杆菌的分型效果,利用6种限制性内切酶对33株空肠弯曲杆菌进行了基因分型研究,结果发现,BamHⅠ是单酶中分型效果最好的一种限制性内切酶,结合KpnⅠ和SacII,可以提高PFGE在空肠弯曲杆菌基因分型中的效果.     

Preparation of high molecular weight （HMW） genomic DNA from tea plant （Camellia sinensis） for BAC library construction

A bacterial artificial chromosome （BAC） library is an invaluable resource tool to initiate tea plant genomics research, and the preparation of high molecular weight （HMW） genomic DNA is a crucial first step for constructing a BAC Library. In order to construct a BAC library for enhancing tea plant genomics research, a new method for the preparation of tea pant high molecular weight （HMW） genomic DNA must be developed due to young tea plant leaves and shoots are notably rich in both tea polyphenols and tea polysaccharides. In this paper, a modified method for preparing high quality tea plant HMW genomi~ DNA was optimized, and the quality of tea plant genomic DNA was evaluated. The results were as follows： Critical indicators of HMW DNA preparation were the appearance of the smooth nuclei in solution （as opposed to sticky-gummy） before agarose plug solidification, non-dark colored nuclei plugs after lysis with an SDS/proteinase K solution, and the quality and quantity of HMW DNA fragments after restriction enzyme digestion. Importantly, 1% dissolved PVP-40 and 1% un-dissolved PVP-40 during the nuclei extraction steps, in conjunction with the removal of PVP-40 from the plug washing and nuclei lysis steps, were critical for achieving HWM tea plant DNA suitable for BAC library construction. Additionally, a third PFGE fraction selection step to eliminate contaminating small DNA fragments. The modifications provided parameters that may have prevented deleterious interactions from tea polyphenols and tea polysaccharides. The HMW genomic DNA produced by this new modified method has been used to successfully construct a large-insert tea plant BAC library, and thus may be suitable for BAC library construction from other plant species that contain similarly interfering compounds.     

山东猪产业链中大肠杆菌耐药性及传递的研究

为比较养殖区猪"养殖-屠宰-销售"产业链各个环节中大肠杆菌的耐药性状况,及其在动物与动物、与人之间传递的情况,采集猪产业链中多个环节的样品,分离大肠杆菌150株,用肉汤稀释法检测细菌对常用药物的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并对所有菌株进行脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型分析。研究结果表明养殖环节中(包括饲养员)细菌耐药程度普遍较高且呈现多重耐药性,屠宰、加工和销售过程中细菌耐药程度较低;在仔猪、哺乳母猪和怀孕母猪之间,及保育猪和饲养员之间存在PFGE型高度相似的菌株,而PFGE型相似菌株的耐药性则存在不同程度的差异。说明良好的屠宰条件在一定程度上能够阻断养殖环节形成的高耐药性菌株的传递,耐药性大肠杆菌菌株可以在密切接触的人和动物之间传播。评估猪产业链中动物源条件致病菌及耐药性的转移扩散风险,对食品安全和公共卫生具有一定参考价值。     

根瘤菌参比菌株23S rRNA基因数量和定位及其系统发育群

    为了明确23S rRNA基因数量和定位是否可更好地揭示根瘤菌参比菌株的系统发育关系,采用I-CeuI酶切和脉冲场凝胶电泳(PFGE)结合的方法,对根瘤菌株23S rRNA基因的数量和定位进行分析,并依据其相似性进行聚群.结果显示.根瘤菌参比菌株可聚为19个系统发育群.其中,在属的水平上,13个系统发育群与现行分类群(不包括依据16S rRNA基因序列分析结果)一致,6个不一致.在种的水平上,现行分类群中同种的根瘤菌可进一步细分为不同的系统发育群.这表明:I-CeuI酶切和PFGE结合的方法能从基因组特征角度对根瘤菌参比菌株进行更加细化的系统发育分类,并使其属种间的同质性更好.     

串珠镰孢D和E两个交配群电泳核型的研究

利用脉冲电泳技术研究了串珠镰孢Ｄ交配群和Ｅ交配群间及同一交配群的寄主和地区来源菌株电泳核型的相似性或多样性。结果显示,串珠镰孢Ｄ交配群菌株有９～１０条染色体,不同染色体ＤＮＡ分子量范围为０．７～６．１Ｍｂ,基因组大小约为３３．３～３７．９Ｍｂ;Ｅ效配群供试菌株分离出４～７条染色体,染色体ＤＮＡ分子量变化范围为０．７～４．８Ｍｂ,部分基因组大小约为９．０～２１．４Ｍｂ。电泳核型分析结果表明,在串珠镰     

转基因玉米的脉冲电泳技术检测及遗传分析

采用脉冲电泳技术将外源Bar基因和 B.t基因转化玉米种胚并直接成苗,对T0代、T1代经除草剂筛选的抗性植株进行PCR检测.结果表明,T1代转基因植株频率明显低于T0代PCR阳性植株率,T0代植株的PCR阳性率与T1代转基因植株频率呈显著正相关(r =0.9874).T1代表现为PCR阳性的植株Southern杂交结果显示脉冲电泳法介导的外源基因在受体中多为单拷贝,且能从T1代遗传到T2代,外源基因在T2代呈典型的孟德尔分离方式.     

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有10⁴个克隆的双元细菌人工染色体（BIBAC）基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。图8参18     

仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术的优势(摘要)(英文)

[目的]研究仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术,为单细胞凝胶电泳技术寻求另一种可行的电泳方法提供参考。[方法]将仿火箭电泳方法应用于单细胞凝胶电泳技术,检验单细胞水平上的DNA损伤,并与传统的电泳方法比较,分析其优劣势。[结果]在细胞DNA未受损状态下,2种电泳方法所得的结果一致;而在细胞DNA受到损伤时,传统的电泳方法下一些细胞的慧尾发散出现漂移,仿火箭电泳方法得到的慧尾图像集中且未发生偏移。[结论]仿火箭电泳方法较传统的电泳方法存在一定优势。     

毛细管电泳快速检测限制性内切酶酶切产物

[目的]建立1种利用毛细管电泳快速、高效检测限制性内切酶酶切产物的方法。[方法]以甲基纤维素(MC)为筛分介质,用PBR322/BsuRⅠDNA Marker为试验对象,研究筛分介质浓度、pH值、毛细管柱温度和电场强度对毛细管电泳法分离小片段双链DNA的影响,寻求最佳电泳条件,并将此方法用于检测MspⅠ内切酶的酶切产物。[结果]MC浓度对双链小片段DNA的分离度有较大影响。随MC溶液浓度的增加,分离度呈先增后减的趋势。毛细管电泳的最佳条件为:MC浓度为2.0%,pH值为8.0,毛细管柱温度15℃,电场强度为275 V/cm。在此条件下,对MspⅠ内切酶的酶切产物进行检测,在20 min内检测到3个酶切片段。[结论]与平板凝胶电泳相比,运用毛细管电泳检测小片段限制性内切酶酶切产物更高效。     

仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术的优势

[目的]研究仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术,为单细胞凝胶电泳技术寻求另一种可行的电泳方法提供参考。[方法]将仿火箭电泳方法应用于单细胞凝胶电泳技术,检验单细胞水平上的DNA损伤,并与传统的电泳方法比较,分析其优劣势。[结果]在细胞DNA未受损状态下,2种电泳方法所得的结果一致;而在细胞DNA受到损伤时,传统的电泳方法下一些细胞的慧尾发散出现漂移,仿火箭电泳方法得到的慧尾图像集中且未发生偏移。[结论]仿火箭电泳方法较传统的电泳方法存在一定优势。     

仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术的优势（摘要）

[目的]研究仿火箭电泳应用于单细胞凝胶电泳技术,为单细胞凝胶电泳技术寻求另一种可行的电泳方法提供参考。[方法]将仿火箭电泳方法应用于单细胞凝胶电泳技术,检验单细胞水平上的DNA损伤,并与传统的电泳方法比较,分析其优劣势。[结果]在细胞DNA未受损状态下,2种电泳方法所得的结果一致;而在细胞DNA受到损伤时,传统的电泳方法下一些细胞的慧尾发散出现漂移,仿火箭电泳方法得到的慧尾图像集中且未发生偏移。[结论]仿火箭电泳方法较传统的电泳方法存在一定优势。