小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

小麦黄花叶病毒的血清学检测

利用间接ELISA对感染WYMV的小麦病叶检测,通过比较分析影响ELISA测定结果的包被缓冲液、抗血清及酶标抗体的浓度和种类,确立了较为稳定的反应体系.利用此ELISA检测体系并结合RT-PCR方法对从四川采集的田间小麦中WYMV进行检测,确定了有较高的检测灵敏度的检测系统,为田间大量小麦病样的检测提供有效、方便的方法.     

土传线状小麦黄花叶病毒浦江分离物Nb基因的克隆及序列分析

根据已发表的日本小麦黄花叶病毒ＲＮＡ１核苷酸序列，设计了一对引物Ｎｂ０１／Ｎｂ０２，用来扩增浙江浦江土传线状小麦黄花叶病毒分离物Ｎｂ基因的全长序列。     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

用放射免疫吸附测定法检测大麦黄矮病毒及雀麦花叶病毒

放射免疫吸附测定法(Radioimmunosorbent assay RISA)是一种灵敏、快速检测植物病毒的方法,它的灵敏度高于酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked immunoso-sorbent assay ELISA)。作者应用~(125)I分别标记雀麦花叶病毒(Brome Mosaic VirusBMV)和大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus BYDV)免疫γ-球蛋自,进了行病毒检测,取得了较为满意的结果,这为进行蚜虫带毒率的测定和病害流行测报打下基础。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒提纯和抗血清制备

采用PEG沉淀并结合差速离心技术,获得了精提纯的侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV-Li).提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线.OD260 nm/OD280 nm=1.236.将提纯病毒免疫兔子制备得CMV-Li抗血清.经微量沉淀法和间接ELISA法测定,其效价分别为1∶1024、1∶4096.两种方法相比,间接ELISA具有灵敏度高、特异反应强等优点.     

侵染水仙的虎眼万年青花叶病毒外壳蛋白的原核表达、抗血清制备及应用

采用特异性表达引物PCR扩增了一个从英国围裙水仙样品上分离的虎眼万年青花叶病毒外壳蛋白基因序列.构建原核表达载体,制备了OrMV分离物的外壳蛋白抗血清.对制备的抗血清进行了Western-blot检测,血清学关系研究并应用于样品的间接ELISA检测.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒抗血清制备及应用

用葫芦[Lagenaria siceraria（Molina）Stand．]作为黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的繁殖寄主,通过差速离心和PEG二次沉淀法进行病毒提纯,用提纯病毒液免疫新西兰兔制备CGMMV抗血清。制备的CGMMV抗血清经间接ELISA法测定效价为1：5120;利用制备的抗血清检测田间样品,证明其可以用于CGMMV的血清学及免疫捕获RT—PCR检测。研究结果对今后开展葫芦科作物CGMMV检测,及时发现疫情以便采取防控措施,避免病毒扩散为害,确保葫芦科作物的安全生产具有重要意义。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.     

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。     

小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的RT-PCR检测

小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）是葫芦科作物上的一种重要病毒,近几年来已成了我国葫芦科作物上的一种重要病原物。根据已知的ZYMV基因组序列分别设计了2对特异性引物,在优化RT—PCR条件的基础上,成功建立了ZYMV的RT—PCR检测方法。引物ZYM1／ZYM2用于扩增整个CP基因序列（片段长度949bp）,而引物ZYM3／ZYM4用于扩增部分CP基因序列（片段长度449bp）,其中,引物ZYM3／ZYM4的检测灵敏度比引物ZYM1／ZYM2的检测灵敏度高。把所建立的方法用于南瓜（Cucurbita moschata）、丝瓜（如如cylindrica）病叶的检测,结果在这些病叶中也检出ZYMV。因此,该方法可用于ZYMV的快速、灵敏检测及分子流行病学的调查研究。     

黄瓜花叶病毒（CMV）高效价抗血清的制备及其在ELISA中的应用

以提纯的ＣＭＶ作为抗原，经静脉注射，肌肉注射和足垫注射等对家兔进行免疫，获得高效价的抗血清（琼脂双扩散效价为１／２５６），在间接ＥＬＩＳＡ试验过程中，用ＰＢＳ＋０．０５％，ＴｒｉｔｏｎＸ－１００作为样本研磨液，用１：１６０００稀释度的ＣＭＶ抗血清或２μｇ／ｍｌＣＭＶ抗血清的ＩｇＧ作为第一抗体，用１：１０００稀释度的冻干辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的ＩｇＧ作为第二抗体，以待测样本光密度值与阴性对照光密     

罗汉果叶病毒（WMV—2—Luo）抗血清制备及ELISA检测技术研究

用西葫芦作为罗汉果花叶病毒（WMV－2－Luo)的繁殖寄主，通过差速离心和PEG二次沉淀法得到WMV－2－Luo的提纯液，用该病毒提纯液免疫日本大白兔，获得了WMV－2－Luo兔抗血清。经ELISA测定，其效价为1／5 120，以0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8，含1．5％NaDIECA)作为样品制备缓冲液，用间接ELISA法检测WMV－2－Luo的灵敏度为1／3 200。用此方法检测罗汉果组培苗带毒情况和田间株均获得成功。     

甘蔗花叶病毒辅助成分-蛋白酶基因原核表达及抗血清制备

利用RT-PCR克隆甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV) DWK1分离物辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase,HC-Pro)基因,酶切后连接原核表达载体pEHISTEV,得到重组质粒pEHISTEV-SCMV-HC-Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta,经IPTG诱导后,表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白,多点注射法免疫新西兰长耳兔,制备SCMV HC-Pro抗血清。间接ELISA结果表明,该血清效价为1∶8 192。感染DWK1的玉米叶片病汁液稀释128倍时,该血清仍然能够有效检测出HC-Pro。Western-blot检测结果表明,该血清可特异性检测SCMV第Ⅰ组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2,与同属的烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和马铃薯Y病毒(PVY)均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC-Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。     

小麦黄花叶病毒P3蛋白致病功能域的鉴定和分析

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus),其基因组由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。先前的研究表明,马铃薯Y病毒组多种病毒编码的保守蛋白P3具有多种功能,在病毒复制、致病性、克服宿主抗性、细胞间移动等方面均具有重要作用,而P3在大麦黄花叶病毒属中是否有类似功能目前还未见报道。本研究利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的本氏烟基因沉默系统,明确了WYMV的P3碳端在本氏烟上具有致病功能域P3-C,但完整的P3则不具有致病能力。进一步移码突变研究表明,P3-C的致病性是由其编码的多肽引起的,而非病毒来源的小干扰RNA介导的宿主基因沉默。同时P3-C的两个跨膜结构域对致病性具有重要作用,单独表达任何一个跨膜结构域P3-C均不能在本氏烟上引起明显症状。     

土传小麦花叶病毒基因组结构和RNA2自发缺失的研究

描述了土传小麦花叶病毒（ｓｏｉｌ－ｂｏｒｎｅ ｗｈｅａｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ,ＳＢＷＭＶ）的基因组结构,并将之与一些植物病毒作比较。发现重复摩擦接种或在高温下（２５￣３０℃）培养引起的ＳＢＷＭＶ部分ＲＮＡ２序列迅速缺失。在最初几次重复摩擦接种后,小麦病株存在野生型ＳＢＷＭＶ ＲＮＡ２和几个不同大小的外壳蛋白通读（ＣＰ－ＲＴ）基因的缺失突变体。在以后的几次重复摩擦接种后,一个缺失突变体成为占优     

大豆花叶病毒间接ELISA检测方法的建立及应用

为快速有效地检测大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV),本研究利用已制备的大豆花叶病毒衣壳蛋白(Coat Protein,CP)及其单克隆抗体,通过优化ELISA条件为:检测材料抗原包被酶标板37℃1 h,检测抗体工作浓度125 ng/mL,孵育60 min,酶标抗体工作浓度100 ng/mL,孵育30 min;SMV CP蛋白最低检测限为3.23 ng/mL;该方法重复性变异系数小于3%,重复性良好;运用上述检测条件与RTPCR检测方法对田间样品进行随机检测,结果显示一致率高达94%。SMV间接ELISA检测方法的成功建立,为SMV快速检测试剂盒及试纸条的研发奠定了基础。     

南芥菜花叶病毒外壳蛋白的克隆表达及抗血清的制备

依据报道的ArMV外壳蛋白基因(coat protein,cp)序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到长约990bp的ArMV cp基因亲水基团部分片段,将目的片断克隆到原核表达载体pEGX-6p-1中,构建ArMV cp基因与GST蛋白融合表达载体pEGX-cp,重组载体化大肠杆菌BL21,经IPITG诱导后,融合蛋白GST-cp得到了特异表达。用12%的SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为63.2 kDa主要以包含体的形式存在。用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗体,免疫家兔后得到特异性较强的抗血清,经酶联免疫法检测效价为1∶100 000。