减蛋综合征病毒PVⅢ蛋白基因的扩增克隆与鉴定

应用降落PCR法对减蛋综合征病毒PVⅢ蛋白基因进行了扩增，结果得到1．1kb的扩增产物。将该扩增产物克隆至pMDl8-T载体中，经酶切和PCR鉴定后，证明了目的片段的正确性，从而实现了EDSV-gDNA PVⅢ基因的克隆，这不仅为进一步阐明EDSV PVⅢ结构与功能的关系打下了基础，而且为PVⅢ基因的表达及EDS基因工程苗的研究也奠定了良好的基础。     

应用PCR技术检测鸡产蛋下降综合征病毒

根据已发表的鸡产蛋下降综合征病毒(egg drop syndrome virus,EDSV)基因序列设计特异性引物,目的基因片段大小为273 bp,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对EDSV进行扩增。结果表明,该方法对EDSV标准株扩增为阳性,对鸡新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病毒及肾型传染性支气管炎病毒的扩增结果均为阴性。应用PCR技术对试验样品进行检测,均能够扩增出预期的DNA片段。由此可以得出,PCR技术可以用于鸡产蛋下降综合征病毒的检测。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

胶体金快速诊断方法对鸡减蛋综合征病毒的检测

选择15nm的胶体金颗粒作为标记物，制备了鸡减蛋综合征病毒（EDSV）胶体金试纸条。该试纸条能检出浓度约为1．35μg／mL的纯化EDSV，用该试纸条检测135份临床样本，并与HA方法相比较，结果显示，二者的阳性符合率为89．8％。特异性试验结果显示，与鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）无交叉反应。表明，该试纸条用于检测EDSV具有快速、操作简便、特异性强等优点，可用于大批量抗原样本的检测。     

鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒二重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上已发表的鸭坦布苏病毒(DTMUV)NS5基因序列和产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列,分别设计了检测DTMUV和EDSV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为242 bp和181 bp。通过退火温度及引物浓度的优化,建立了针对这两种病毒的二重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测DTMUV和EDSV,且不与鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、番鸭呼肠孤病毒、小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒以及大肠杆菌的核酸发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对DTMUV的最低检出限为590个拷贝,对EDSV的最低检出限为3 260个拷贝;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过检测两种病毒感染的阳性病料各10份,结果显示,该二重PCR检测方法对阳性样品的检出率可达100%。这表明该方法可以用于鸭坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒的检测。     

光生物素标记六邻体蛋白基因探针检测减蛋综合征病毒的研究

根据基因文库中减蛋综合征病毒（EDSV）AV127株的序列设计1对引物，从四川本地分离的EDSVSG9301株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到PUC18的多克隆位点中，经PCR、酶切分析、DNA杂交分析和序列测定证明，所扩增、克隆的基因包括了六邻体蛋白基因从起始密码子到终止密码子在内的完整序列。用光生物素对含六邻体蛋白基因的重组质粒标记后，采用斑点印迹法对4株EDSV（标准株AV-127株和3株四川分离株）、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒的核酸进行检测，结果，该探针能检测出4株EDSV，但不能检出新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒。表明该六邻体蛋白基因探针具有特异性，检测的灵敏度高达1pg。     

鸡减蛋综合征病毒的分子生物学研究进展

鸡减蛋综合征是由鸡减蛋综合征病毒(EDSV)引起的以产薄壳或无壳蛋，产生率严重下降为主要特征的传染病。自1976年荷兰科学家、fin Eck等首次报道此病以来，许多国家及地区都报道了此病的流行。我国于20世纪80年代末在肉用种鸡群中发现减蛋综合征以来，许多地区均分离出该病毒?EDSV具有独特的抗原性和生物学特性，各国学者对EDSV的分子生物学研究越来越重视。     

鸭黄病毒感染逆转录半套式PCR检测方法的建立

根据GenBank发布的黄病毒Bagaza毒株的NS3基因的保守序列设计了3条引物,建立了一种适用于鸭黄病毒的半套式PCR快速检测方法。采用该方法对鸭黄病毒山东分离株进行检测,结果半套式PCR对2株分离株均能扩增出277bp的特异性条带,而对鸭瘟病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒的扩增结果均为阴性;经检测该方法第1次扩增的敏感性为1×105拷贝/μL,第2次扩增的敏感性为1×102拷贝/μL,第2次扩增的敏感性比第1次高103倍;该方法对山东省各地采集的24份疑似病料可检出22份阳性。表明本试验所建立的套式PCR方法可用于鸭黄病毒感染的临床诊断和流行病学调查。     

应用二重实时荧光定量RT-PCR鉴别坦布苏病毒与产蛋下降综合征病毒

为更加快速敏感地对两种导致产蛋下降的禽类病毒:坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒进行鉴别,试验建立了一套二重实时荧光定量RT-PCR方法。通过针对两种病毒的特异保守序列,设计两套引物和探针,分别标记不同的荧光基团和淬灭基团,并优化反应体系。结果显示:建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法只扩增这两种病毒的目的片段,无交叉扩增反应,与其他常见禽类病原体也无扩增反应;该检测体系最低可同时检测100个拷贝的坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒,比常规PCR和RT-PCR敏感10~100倍;检测30份样品,共检出7份EDSV阳性,6份TMUV阳性,与病毒分离结果符合。表明建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速、敏感、特异地鉴别诊断坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒。     

鸭坦布苏病毒、产蛋下降综合征病毒和H9亚型禽流感病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上已发表的产蛋下降综合征病毒(EDSV)五邻体(penton)基因序列、H9亚型禽流感病毒的HA基因和鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因序列,分别设计了检测EDSV、H9 AIV和DTMUV的特异性引物,扩增目的片段大小分别为110bp、281bp和266bp。通过PCR验证及引物浓度的优化,建立了针对这3种病毒的三重荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时检测EDSV、H9 AIV和DTMUV,且不与鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒和大肠杆菌基因组DNA以及鸭甲肝病毒1型、鸭甲肝病毒3型、番鸭呼肠孤病毒和新城疫病毒的RNA发生交叉反应;敏感性试验表明,该方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝,该方法比常规PCR方法敏感10倍;该方法重复性良好,对不同批次的样品扩增效果良好。通过标准曲线的建立以及临床样品的检测表明,该方法可以用于EDSV、H9 AIV和DTMUV的定性和定量检测。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR诊断方法的建立与应用

根据GenBank登录的传染性喉气管炎病毒(ILTV)的TK基因序列设计并合成1对特异性引物,以ILTV疫苗株DNA为模板,建立了检测ILTV TK基因的PCR方法。应用该方法能从临床分离毒株和疫苗株中扩增到长为427 bp的目的片段;但不能从新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等病原中扩增出阳性条带;敏感性试验表明其DNA最小检出量为4.9 ng;应用该方法和病毒分离法对2份临床病例和人工感染鸡的检测,两者符合率为100%。上述结果表明该PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于传染性喉气管炎病毒鉴定和临床诊断。     

鸭减蛋综合征抗体消长规律初步研究

减蛋综合征(Egg drop syndrome,EDS-76)是由减蛋综合征病毒(EDSV)引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病。减蛋综合征病毒又称鸭腺病毒,一些研究表明,尽管发生疾病都是在产蛋鸡,但鸭才是EDSV的天然贮存宿主[1],鸭在自然条件下感染EDSV     

Ⅰ群禽腺病毒套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种特异、敏感的Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)检测方法,根据GenBank中FAdV-Ⅰ不同血清型Hexon基因序列,选择保守区域设计内、外2对特异性检测引物,通过反应条件的优化,建立了FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法。结果:该方法能够特异性扩增FADV-Ⅰ,而检测减蛋综合征病毒(EDSV)、鸡痘病毒(APV)、马立克病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸭瘟病毒(DEV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)均为阴性;检测下限为10~(2.0) TCID_(50),灵敏度是普通PCR方法的100倍;对3个不同浓度FAdV-Ⅰ的批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;相对于病毒分离鉴定方法的符合率为90.91%;用该方法检测91份临床病料样品,共检测出阳性样品58份,其中血清4型、8a型、8b型、11型阳性样品分别为38份、8份、7份、5份。结果说明本试验建立的FAdV-Ⅰ套式PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性,能够用于FAdV-Ⅰ的临床检测。     

鸡减蛋综合征病毒广西分离株的鉴定及灭活油佐剂疫苗的研究

通过电镜观察、理化特性、致病性、血凝性及血清型鉴定，证实从广西鸡减蛋综合征（egg drop syndromes,EDS）抗体阳性鸡群所产软壳蛋蛋清中分离的毒株GEV属鸡减蛋综合征病毒（EDSV），与EDSV国际标准毒株AV127属同一血清型。用GEV株研制的灭活油佐剂疫苗，每只鸡肌肉注射0．5mL、1．0mL均能产生高效价EDS抗体，且持续至少5个月以上。     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定

为了对广东地区某鸽场疑似鸽新城疫病毒感染的鸽群进行病原学诊断,试验采用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、F基因扩增及序列测定等一系列综合试验对其进行病原学鉴定。结果表明:该分离株具有血凝活性,且这种血凝性可被新城疫病毒(NDV)标准阳性血清抑制,而不能被减蛋综合征病毒(EDSV)、禽流感病毒(AIV)-H5、AIV-H7、AIV-H9阳性血清抑制;用针对NDV F基因设计的特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,可扩增出相应的目的片段;该分离株与天津分离株AG/Tianjin/07的核苷酸序列的相似性高达99%。说明该分离株为鸽新城疫病毒,命名为Pigeon/Guangdong/SD54/2006。     

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314 bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。     

猪链球菌2型PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖基因序列设计1对引物,建立了猪链球菌2型PCR诊断方法,该方法对猪链球菌2型的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪链球菌2型检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测40份猪链球菌疑似病料,检出阳性病例12份。以上结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪链球菌2型疾病的诊断。     

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的建立和应用

根据猪肺炎支原体P36基因序列,设计1对引物,建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法,该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料,检出阳性病例18份,以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速,可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。     

J亚群禽白血病病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽白血病病毒(ALV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为478 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合ALV快速检测的套式PCR方法(nested-PCR)。采用该方法对ALV毒株进行了检测,试验结果表明,能扩增到314 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽网状内皮增生病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10⁵倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽白血病病毒(ALV)的临床诊断和分子流行病学调查等。