蜡梅水通道蛋白基因分子特征分析及植物表达载体的构建

在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序,得到了1个蜡梅水通道蛋白基因,命名为CpAQP(GenBank登录号为:GU433105).cDNA全长1154 bp,最大ORF 810 bp,编码269个氨基酸.聚类分析和同源性比对表明,该蛋白基因属于TIPS亚族类,具有高度保守的MIP家族结构域.该蛋白具有6个跨膜结构,N-末端和C-末端都在细胞内.利用NetPbos 2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预浏,该蛋白C端丝氛酸磷酸化,可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用.将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP.     

蝴蝶兰MADS-Box基因克隆及植物表达载体的构建

【目的】克隆蝴蝶兰MADS-Box基因并构建其正义和反义植物表达载体,为其功能研究奠定基础。【方法】以蝴蝶兰杂交品种(Phalaenopsis hybrid cv.Jiuhbao Red Rose)为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术从花葶中克隆MADS-Box基因,并构建正义和反义植物表达载体。【结果】克隆获得一个蝴蝶兰MADS-Box基因,命名为DtpsMADS1(GeneBank登录号JQ065097)。该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp的5'非编码区、185 bp的3'非编码区和一个738 bp的编码区;该基因编码245个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白质为碱性亲水性蛋白,具有62.45%的α-螺旋,8.16%的延伸链和29.39%的不规则折叠。序列比对和系统进化分析结果表明,DtpsMADS1与蝴蝶兰ORAP13的亲缘关系最近,同源性达99.0%,与石斛和蕙兰的同源性分别为83.0%和82.0%,属于MADS家族A类亚家族。将DtpsMADS1基因连接到植物表达载体pBI121上,构建获得正、反义植物表达载体pBI121-DtpsMADS1-S和pBI121-DtpsMADS1-A。【结论】成功克隆的蝴蝶兰DtpsMADS1基因属于MADS家族A类亚家族,具有明显的保守性和特异性,可为蝴蝶兰DtpsMADS1基因功能的鉴定及蝴蝶兰的遗传改良奠定基础。     

石蒜捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的克隆和序列分析

根据捕光叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)家族中的保守序列设计PCR引物,扩增出的约350bp cDNA小片段为分子杂交探针,对构建的石蒜全长cDNA文库进行杂交筛选,并结合PCR分析对阳性克隆进行测序分析验证,克隆了石蒜中1个Cab基因全长cDNA,命名为LrCab(GenBank 登记号:GU362887).LrCab长为1073 bp,从第50 bp开始至847bp含有1个开放阅读框和1个终止密码子,编码 265个氨基酸.LrCab编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5.14和28 010.00 u.通过比较分析,LrCab DNA序列(GU362887)和编码的氨基酸序列与其他种属的Cab基因编码氨基酸序列相似性很高,表明Cab家族基因在进化过程中保守性高.     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

薹菜CYP79B5基因的克隆及原核表达

以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸.以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段.经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%.经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构.扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在相对分子质量64 000处有一特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致.     

白羽王鸽卵清蛋白关联蛋白Y基因(OVALY)克隆与生物信息学分析

旨在获得白羽王鸽(Columba livia)卵清蛋白关联蛋白Y基因(OVALY)的cDNA序列,并进行生物信息分析。研究结果显示:OVALY基因cDNA全长为2 068 bp,其中5'非编码区序列180 bp,3'非编码区序列720 bp,开放阅读框1 164 bp,编码的蛋白分子量约44.19 ku,含氨基酸残基388个(GenBank∶KX230792);与NCBI数据库中朱鹮(Nipponianippon)OVALY基因序列同源性最高(81%),与白尾鹰(Haliaeetusalbicilla)和沙鸡(Pteroclesgutturalis)OVALY基因序列的同源性分别为80%和79%。经潜在糖基化位点和磷酸化位点预测分析发现,OVALY蛋白结构中潜在糖基化位点和磷酸化位点分别为4个和22个;经CDD(conserved domain database)数据库分析发现,OVALY蛋白具有丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的反应中心区域,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。     

蜡梅水通道蛋白基因（CpAQP）分子特征分析及植物表达载体的构建

在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序,得到了1个蜡梅水通道蛋白基因,命名为CpAQP(GeneBank登录号为：GU433105)。cDNA全长1154 bp,最大ORF 810 bp,编码269个氨基酸。聚类分析和同源性比对表明,该蛋白基因属于TIPs亚族类,具有高度保守的MIP家族结构域。该蛋白具有6个跨膜结构,N-末端和C-末端都在细胞内。利用NetPhos2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预测,该蛋白C端丝氨酸磷酸化,可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。     

温带臭虫细胞色素P450 CYP4C1蛋白生物信息学分析

为阐明CYP4家族基因在温带臭虫(Cimex lectularius)解毒代谢机制中的作用,应用生物信息学软件对温带臭虫CYP4C1蛋白的结构与生物学特性进行预测和分析.通过GenBank数据库获得温带臭虫CYP4C1基因与CYP4C1蛋白序列信息,利用生物信息学软件对CYP4C1基因、CYP4C1蛋白进行分析;并构建系统发育树.结果表明,温带臭虫CYP4C1的cDNA编码区全长为1053bp,编码500个氨基酸;第5～23位氨基酸为疏水区;不稳定指数为37.85;在5～27位氨基酸之间形成1个典型的跨膜区;无信号肽结构;亚细胞定位在细胞质中;具19个磷酸化位点,3个糖基化位点以及4个N-酰基化位点;二级结构预测显示,主要结构元件为α-螺旋和无规卷曲;含3个二硫键;含P450结构功能域.     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

番木瓜CYP79A2基因片段的克隆与序列分析

苯丙氨酸氮羟化酶是植物中催化异硫氰酸苄酯(BITC)生物合成的第1个酶。笔者以番木瓜嫩叶总RNA反转录得到的cDNA为模板,依据拟南芥(NM-120608)和油菜(EU877074)的CYP79A2基因序列,并结合番木瓜的全基因组序列草图设计引物,进行PCR扩增,得到了大小为923bp的基因片段,命名为CP-CYP79A2。生物信息学分析结果表明,其为番木瓜的CYP79A2基因片段。为进一步研究番木瓜BITC的生物合成调控打下了良好的基础。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5＇-UTR为61bp,ORF为678bp,3＇-UTR为108bp且包含29bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62bp处,终止密码子TAA位于737bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%～48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847 bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5'-UTR 为61 bp, ORF为678 bp,3'-UTR为108 bp且包含29 bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62 bp处,终止密码子TAA位于737 bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%~48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

木薯氰化物合成限速酶CYP79D2基因克隆与序列分析

 亚麻苦苷和百脉根甙等氰化物是木薯块茎、茎叶等组织或器官中的剧毒物质,细胞色素p450是调控氰化物生物合成的关键酶基因,克隆有关酶基因对于理解木薯氰化物代谢和通过转基因对木薯氰化物的改良具有重要意义。根据国际数据库中的木薯氰化物合成限速酶基因序列信息,设计特异引物,通过同源克隆法,从木薯中克隆出1626bp cDNA基因序列。序列分析表明,克隆基因共编码541个氨基酸,与数据库中的木薯CYP79D2基因在核苷酸序列、氨基酸序列同源性上均达到99％,并含有相应基因家族的保守区域,确定克隆到木薯CYP79D2全长基因。     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

瓜螺线粒体全基因组密码子偏好性分析

【目的】探究瓜螺（Melo melo）线粒体全基因组密码子使用偏好性,明确影响密码子偏好性的因素,为提高基因表达效率及了解瓜螺线粒体基因组的特性和进化方向提供科学依据。【方法】以瓜螺线粒体全基因组序列为研究对象,从中筛选出11条长度大于300 bp且以ATG为起始密码子的非重复基因序列,利用CodonW 1.4.2、Excel 2017及SPSS 22.0等软件进行瓜螺线粒体全基因组密码子偏好性分析。【结果】不同基因序列密码子位置所对应的G+C含量不同,其中,GC₁（密码子第1位所代表的G+C含量）、GC₂（密码子第2位所代表的G+C含量）、GC₃（密码子第3位所代表的G+C含量）的变化范围分别为35.20%~51.90%、16.40%~40.60%和13.10%~34.90%,对应平均值为41.15%、32.29%和23.71%,GC₁和GC₂明显高于GC₃;密码子适应指数（CAI）在0.110~0.180,平均为0.137;密码子偏好性指数（CBI）在-0.272~-0.090,平均为-0.175;最优密码子使用频率（FOP）在0.216~0.339,平均为0.277;有效密码子数（ENC）在36.84~53.75,平均为45.59;总平均亲水性（GRAVY）在0.480~1.394,平均为0.968。有30个同义密码子的相对使用度（RSCU）大于1.00,且主要以A/U结尾。中性绘图分析发现,GC₁和GC₂平均值（GC₁₂）与GC₃的相关系数为-0.438,相关性不显著（P>0.05,下同）;ENC-plot绘图分析结果显示,各散点（基因）均位于标准曲线附近,其中,NAD4、COX2和NAD3基因位于标准曲线上方,COX1、ATP6、NAD1、NAD6、COB、NAD5、COX3及NAD2等8个基因位于标准曲线下方;在对应性分析中,第一、第二、第三、第四向量轴的贡献率分别23.12%、15.19%、13.17%和9.63%,前4轴累计差异为61.12%。综合高频密码子与高表达密码子,最终筛选出4个最优密码子（UUU、GUU、ACU和CAU）,且均以U结尾。【结论】瓜螺线粒体全基因组密码子偏好以A/U结尾的形式,筛选出的4个最优密码子（UUU、GUU、ACU和CAU）均以U结尾。除了自然选择在瓜螺线粒体全基因组密码子偏好性形成中占主导地位外,突变压力和碱基组成也影响其密码子偏好。因此,可通过瓜螺目的基因密码子优化,有效提高外源基因表达且优化性状决定基因,从而加速瓜螺优良亲本培育的进程。     

虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析.结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变.关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P＜0.05).本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考.     

微生物生长代谢热动力学研究概况

概述了橡胶籽粕中氰苷的结构与性质,介绍了其测定方法（包括定性检测与定量检测）以及微生物脱氰苷的方法（如坑埋法、瘤胃液微生物发酵法、微生物固体发酵法）。     

黄丹木姜子叶绿体基因组特征分析

【目的】分析黄丹木姜子（Litsea elongata）叶绿体基因组特征,为木姜子属物种鉴定、遗传多样性分析和资源保护提供理论参考。【方法】基于Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对黄丹木姜子叶绿体基因组进行测序,利用GeSeq在线工具对叶绿体基因组进行注释,并利用REPuter、MISA、CodonW和IQ-TREE等生物信息学软件对其基因组结构、基因数目、序列重复、密码子使用偏性和系统发育进行分析。【结果】黄丹木姜子叶绿体基因组全长为154028 bp,具有典型的四分结构,编码126个基因,其中蛋白编码基因82个,rRNA基因 8个,tRNA基因 36个。叶绿体基因组的注释基因中,有9个基因含1个内含子,有3个基因含有2个内含子,其余基因均不含内含子;44个基因编码蛋白参与光合作用信号途径,21个基因编码蛋白构成了核糖体大小亚基。黄丹木姜子叶绿体基因组含有32对长序列重复和90个SSR位点,其中,正向重复和回文重复最多,均为12对,反向重复和互补重复分别为6和2对;95.56%的SSR位点位于单拷贝区［大单拷贝区（LSC）和小单拷贝区（SSC）］,仅4.44%的SSR位点位于反向重复区（IR）。黄丹木姜子叶绿体蛋白编码基因GC含量为39.14%,GC3s为27.95%,平均有效密码子数（ENC）为49.04,说明其密码子偏性弱;相对同义密码子使用度（RSCU）大于1.00的密码子31个,其中13个以A结尾,16个以U（T）结尾。系统发育进化树分析结果显示,木姜子属的14个物种聚为两组,其中黄丹木姜子和10种木姜子属植物聚在一个组,与日本木姜子的亲缘关系最近。【结论】黄丹木姜子叶绿体基因组结构保守,偏好A或U（T）结尾的密码子,鉴定的SSR位点可用于物种鉴定和群体遗传学研究。     

麻核桃CBF基因的克隆与生物信息学分析

CBF基因是植物CBF抗冷途径的枢纽,对增强植物抗冷能力极为重要。本研究根据已知的核桃CBF基因序列设计通用性引物,对麻核桃cDNA进行PCR扩增,成功获得麻核桃CBF基因全长序列,命名为JhCBF。JhCBF全长820 bp,包含一个645 bp的开放读码框（ORF）,编码214个氨基酸。序列分析表明JhCBF与其他物种来源的CBF具有较高的同源性,其中,与桦木科白桦的同源性最高,为61.22%;JhCBF含有一个预测的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。系统进化树分析表明JhCBF与桦木科白桦的亲缘关系最近,最先聚为一类。