谷氨酸棒杆菌乳酰谷胱甘肽裂合酶基因克隆、表达及活性分析

乳酰谷胱甘肽裂合酶是生物体内降解丙酮醛的重要酶之一。食品级微生物谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上的NCgl0106预测为乳酰谷胱甘肽裂合酶基因,但尚缺乏实验验证。本试验首先通过pCR技术扩增出预测的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032乳酰谷胱甘肽裂合酶基因lac,并将之与表达载体pET-28a连接,转化BL21(DE3)感受态细胞,成功获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-lac。然后,使用IpTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET-28a-lac表达重组蛋白Lac。SDS-PAGE试验结果表明:重组Lac蛋白在大肠杆菌进行了可溶性表达,其分子量约为14 kDa。最后对重组Lac蛋白进行了分离纯化、活性检测及酶学特性分析。应用His-tag纯化获得的重组蛋白溶液浓度为604.9μg/mL;活性检测显示重组Lac蛋白能催化丙酮醛和谷胱甘肽生成S-D-乳酰谷胱甘肽,表明谷氨酸棒杆菌lac基因是乳酰谷胱甘肽裂合酶基因;酶学特性分析表明重组乳酰谷胱甘肽裂合酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7,金属离子K~+和Ca~(2+)对其活性略有增强作用,Ba~(2+)对酶活性几乎没有影响,Zn~(2+)、Mg~(2+)和Fe~(2+)对酶活性有一定的抑制作用,Co~(2+)和Mn~(2+)几乎完全抑制其活性,酶反应米氏常数K_m值为0.223 2 mmol/L,最大反应速率为0.025 mmol/(L·min)。     

茶氨酸生物合成基因工程菌的构建及重组酶的表达

将来源于Escherichia coli DH5α的γ-谷氨酰转肽酶基因克隆到高表达质粒pET-32α中,并转化E.coli BL21,构建茶氨酸生物合成的基因工程菌.工程菌在温度为20℃,OD600nm为1.5,IPTG浓度为0.1 mmol/L,培养基初始pH为7的条件下,诱导培养6 h,γ-谷氨酰转肽酶的酶活力达...     

海洋弧菌中褐藻胶裂解酶Alg的克隆表达及酶学性质

褐藻胶裂解酶是制备功能性寡糖的关键酶,以基因工程手段构建重组褐藻胶裂解酶,为实现褐藻胶裂解酶向商业酶转化奠定重要基础。以海洋弧菌SS-1总DNA为模板,运用PCR技术克隆得到褐藻胶裂解酶基因Alg,构建重组表达菌株E.coli BL21(DE5α)/p ET28a(+)-Alg,进行诱导表达,产物通过Ni-NTA resin亲和层析柱纯化,研究其酶学性质及酶解产物。结果表明,重组酶的最适pH为8.0,在pH 4.0~9.0范围内,30℃条件下保温2 h,仍能保持60%以上的相对酶活力;最适温度30℃,热稳定实验显示在高于30℃保温2 h其残余酶活力损失40%以上;在添加浓度1 mmol/L离子K~+、Na~+和Mg~(2+)显示对重组酶有明显的促进作用,Cu~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)、Fe~(2+)、Al~(3+)、SDS和EDTA等对该酶抑制作用明显;动力学参数Km为5.93 mg/mL,Vmax为826.44 mg/(mL·min);电离喷雾质谱(ESI-MS)分析其降解褐藻胶产物主要为小分子寡糖。重组酶是具有良好的酶学特性及有效的作用poly(M)降解产生低聚寡糖的双功能酶,可用于褐藻寡糖的制备。     

菊酯类农药降解酶基因原核表达条件的优化

绘制了菊酯类农药降解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-est825的生长曲线,优化了诱导起始菌液浓度、诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间等条件,得到该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌液OD600值为4时,添加终浓度为6g/L的乳糖,37℃诱导8h,酶的表达量最高,酶活为95U/mL,纯化后的重组酶分子量为30.1ku。     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其酶活测定条件优化

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标。现研究拟采用发酵罐培养含pET-30a/ace的表达菌株E.coli BL21(DE3),大量表达纯化螨AChE,利用单因素试验和正交试验优化AChE活性的测定条件。结果表明:发酵培养的重组菌株大量表达约为68kD的朱砂叶螨AChE蛋白。底物浓度、温度、pH和酶浓度等各测定因素对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性存在显著影响。确定朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性测定的最佳反应条件为:底物浓度1mmol/L,pH值7,温度35℃,酶浓度0.5mg/mL。通过体外发酵培养纯化获得了大量的朱砂叶螨AChE重组蛋白,确定了螨AChE活性测定的最佳条件,为进一步研究其酶学性质以及AChE抑制剂的体外筛选奠定基础。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

甲醚菊酯降解菌的分离鉴定及其农药降解酶的纯化

为了获得甲醚菊酯农药降解菌株及其降解酶,采用平板划线培养的方法从湖北省襄阳市农药厂下水道活性污泥中分离细菌,随后使用DEAE-52和CM-52阴阳离子纤维素交换层析柱对细菌中甲醚菊酯降解酶进行部分纯化,并研究纯酶的特性。结果表明,获得了对甲醚菊酯农药有降解作用的菌株XU-3,经过VITEK-32全自动细菌鉴定仪分析,综合其形态、生理生化特性和16S r DNA序列分析结果,将其鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。阴沟肠杆菌XU-3可以生长于甲醚菊酯作为唯一碳、氮源的无机盐培养基中,培养时间为60 h时,能够获取最大量的甲醚菊酯降解酶,降解酶活力达到8.5 U/mL。阴阳离子纤维素交换层析后,该酶纯化了4.4倍,酶活力回收率为66.8%。对收集到的纯酶进行SDS-PAGE不连续凝胶电泳,通过和标准蛋白质Marker比较,其分子质量为74.8 ku。对甲醚菊酯降解酶的特性研究发现,其酶促反应最适温度为35℃,在25~40℃内热稳定性良好;酶促反应最适pH值为8.5,在pH值7.5~9.0内酸碱稳定性良好。反应动力学测定发现,该酶对底物甲醚菊酯的米氏常数Km为0.825 mmol/L,最大反应速率Vmax为0.748 mmol/(L·min)。     

黑曲霉木聚糖酶基因（xynA）在大肠杆菌中的表达及酶学分析

从黑曲霉(Aspergillus niger)F19中克隆得到木聚糖酶基因xynA.将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因段以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a(+)上,并转化E.co-li BL21,获得重组工程菌BLX1.经过IPTG诱导,xynA获得特异性表达,其表达产物以包涵体和胞内可溶性蛋白2种形式存在.经过SDS-PAGE分析,重组蛋白分子质量约为24 ku.酶学分析表明,最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0,在酸性条件下具有较好的稳定性.     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达

根据GenBank上公布的鸡传染性贫血病毒VP1的基因序列设计一系列引物,通过基因扩增得到了鸡传染性贫血病毒(CAV)VP1基因的全长片段和一系列不同N末端截断的VP1基因片段,分别将这些片段插入表达质粒载体pET28a的多克隆位点上,构建成4种重组表达工程菌(E.coli BL21/pET-28-CAVVP1、E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137),研究了4种不同长度VP1片段在重组大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE电泳筛选最佳表达方式。结果表明:E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表达分子质量为44ku的可溶性蛋白,E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表达分子质量为40ku的不可溶性蛋白,而在E.coli BL21/pET-28-CAV VP1和E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137的诱导表达产物中未见明显的表达蛋白出现。其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白将有可能用于研制CAV诊断抗原和亚单位疫苗研究。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测

【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定

【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标。【方法】以pMD19-T-Secda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到Secda2a基因。构建原核表达载体pET-28a-Secda2a,IPTG诱导蛋白表达。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建重组转座载体pFastBac HT A-Secda2a,脂质体转染昆虫细胞Sf9,Western blot对SeCDA2a重组蛋白进行分析,以对硝基苯胺为底物利用分光光度计测定其酶活力。【结果】Secda2a在大肠杆菌和Sf9中均成功表达61kDa的重组蛋白,与预测分子量大小相符。IPTG终浓度为0.50mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高。昆虫细胞Sf9表达的重组蛋白SeCDA2a的酶活力是1.57U/mL。【结论】本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达,测定重组蛋白SeCDA2a的酶活力。     

苦荞蔗糖合酶SuSy基因在大肠杆菌中的表达及其纯化

【目的】探究苦荞蔗糖合酶结构与功能的关系,构建表达载体以实现SuSy基因在大肠杆菌中的表达,并经亲和层析纯化后得到重组SuSy蛋白,为进一步研究该酶的结构和功能奠定基础.【方法】以苦荞(Fagopyrum tataricum)cDNA文库中克隆得到的蔗糖合酶基因重组质粒为模板,PCR扩增得到SuSy编码序列,将其与原核生物表达载体pET28a相连接构建了重组表达载体pET28a-SuSy,经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切及测序鉴定正确后将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达SuSy重组蛋白,并对其诱导表达条件进行优化.【结果】在37℃、1.2 mmol/L IPTG诱导10 h时,SuSy蛋白表达量最高,分子量大小约为53.4 ku,超声破碎后经SDS-PAGE检测到该蛋白以包涵体形式存在.【结论】利用Co~(2+)亲和柱层析纯化和His-tag鉴定得到了高纯度的重组SuSy蛋白,为该酶结构与功能的研究及多克隆抗体制备奠定了基础.     

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。     

三唑磷农药降解酶的定位及酶学性质研究

采用超声波破碎法破碎三唑磷农药降解菌芽孢杆菌TAP-1,研究不同细胞组分对三唑磷农药的降解率,应用液相色谱法研究三唑磷农药降解酶的酶学性质。结果表明,胞外酶、胞间粗酶液和胞内酶对三唑磷的降解率分别为2.8(±0.34)%、12.8(±2.44)%和84.4(±6.71)%。菌株TAP-1降解三唑磷农药的主要活性物质位于降解菌细胞内,属于胞内酶组分。该酶最适作用pH值为6.5~7.0,在pH 5.0~7.5之间,酶活力均能保持在最高酶活力的68%以上。最适反应温度为30℃,在25~40℃温度范围内能保持75%以上的降解活性。不同化学试剂和金属离子对酶活性产生不同的影响。巯基修饰剂、EDTA、Hg~(2+)和Mn~(2+)对酶活性有抑制作用。Mg~(2+)、Co~(2+)和Fe~(3+)对酶活性有促进作用。该降解酶米氏常数(Km)为23.02μmol/L,最大反应速度(Vmax)为0.738μmol/mg·min。     

天冬酰胺酶胞外表达的初步研究

[目的]为降低L-天冬酰胺酶Ⅱ的生产成本提供依据。[方法]通过PCR反应扩增大肠杆菌JM109成熟区的L-天冬酰胺酶II基因(ansB),将扩增片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-asp。对pMD18-T-asp与质粒pET-22b进行双酶切后,将它们连接起来,转化感受态细胞,筛选重组表达载体pET-22b-asp。利用重组表达载体pET-22b-asp转化BL21(DE3),并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究。[结果]成功克隆长度为960 bp的L-天冬酰胺酶II基因。重组表达载体pET-22b-asp也构建成功,并在BL21中得到表达。在重组菌接入TB培养基后2 h加入IPTG、培养基的初始pH值为7.2、装液量为12%,L-天冬酰胺酶Ⅱ酶活最高。重组天冬酰胺酶的纯化收率为82%,比活力达196 U/mg。[结论]重组天冬酰胺酶的胞外表达大大简化了其分离步骤。     

甲氰菊酯降解菌ZH-3的分离鉴定及降解特性

【目的】分离筛选甲氰菊酯的高效降解菌株,为拟除虫菊酯类杀虫剂果蔬残留危害的综合治理提供候选生物制剂。【方法】采用基础盐培养基,从农药厂废水排放口的污泥中筛选降解菌,以甲氰菊酯为唯一碳源进行摇瓶培养复筛,以降解率为评价标准,确定高效降解菌株,根据形态、生理生化特征和16SrDNA序列同源性鉴定其种属,高效液相色谱法研究其降解特性。【结果】分离得到甲氰菊酯高效降解菌株ZH-3,初步鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。菌株ZH-3能有效降解25～300mg/L的甲氰菊酯,在1%接种量、30℃、pH8.0、160r/min条件下,3d内对50mg/L甲氰菊酯的降解率为85.3%。【结论】菌株ZH-3对菊酯类农药的降解作用谱广,对甲氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯及溴氰菊酯等均具有较高的生物降解作用。     

苦马豆素降解酶的酶促降解特性

【目的】研究苦马豆素(Swainsonine,SW)降解酶的酶促降解特性。【方法】应用渗透休克原理,提取SW降解菌株YLZZ-1粗酶液,进行酶促降解研究,并考察SW降解酶的酶活力、动力学参数及稳定性。【结果】YLZZ-1菌株的胞内粗酶液对SW的降解率高达91.73%。SW降解酶对SW酶促降解的最适pH为8.0,最适温度为30℃,在pH6.0~8.5、温度25~45℃具有较好的降解活性,其米氏常数Km为0.073 98 mmol/L,最大反应速度Vmax为0.111 5μmol/(mg.min)。SW降解酶有较好的pH稳定性,但对热不稳定。【结论】菌株YLZZ-1的SW降解酶属于胞内诱导酶,具有良好的降解能力。     

猪链球菌2型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的鉴定和特性分析

利用PCR扩增猪链球菌2型强毒株SS2-1丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(STP)的编码基因,克隆到表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21中进行原核表达,获得重组蛋白质rSsSTP。重组蛋白质经His蛋白质层析柱纯化后,利用pNPP分析rSsSTP的酶活性。结果显示rSsSTP为Mn2+依赖的磷酸酶,最适离子浓度为2 mmol/L,最佳反应温度为37℃,最佳pH值为8.0。