牙鲆SRF基因的克隆及真核表达载体的构建

采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明真核表达载体p EGFP-N1-SRF构建成功,为进一步研究SRF在牙鲆变态发育中的作用奠定了实验基础。     

鸡α干扰素基因的原核和真核表达载体的构建及鉴定

目的:为了构建鸡α干扰素基因真核和原核表达载体。方法:参照Genebank中发表的鸡源α干扰素基因进行密码子优化后,人工合成α干扰素基因片段489 bp,成功构建了干扰素基因克隆载体p MD18-T-IFN-α,经双酶切后,回收获得干扰素基因,分别与原核表达载体p ET-28a和真核表达载体p GAPZαA连接,转化到大肠杆菌Ressota和毕赤酵母中,分别进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:成功构建了原核表达载体p ET-28a-IFN-α和真核表达载体p GAPZαA-IFN-α。结论:成功构建了鸡IFN-α基因的真核和原核表达载体,为鸡IFN-α干扰素的抗病毒活性研究提供了基础。     

翘嘴鳜生长激素cDNA克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列(收录号:AY155227)设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)脑垂体中克隆了生长激素基因(scGH)编码区序列并对其真核表达载体的构建进行了研究。结果显示:扩增片段全长615 bp,共编码204个氨基酸。该序列与GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列同源性为99.84%。将scGHcDNA序列定向插入pYES2/CT真核表达载体中,经过筛选、酶切和测序,证明重组子中确实插入了翘嘴鳜GH片段。     

尼罗罗非鱼Xbp1-S基因克隆及表达分析

为了了解尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)细胞转录因子Xbp1-S(On Xbp1-S)的基因序列特征及其在无乳链球菌(Streptococcus alactolyticus)应激和在B细胞分化中的作用,应用RACE克隆技术获得的On Xbp1-S基因全长1380 bp,包括开放阅读框ORF为1155 bp,5?端非编码区(5?UTR)长127 bp,3?端非编码区(3'UTR)长98 bp。On Xbp1-S序列分析推测该基因编码384个氨基酸,分子量为41.32 k Da,理论等电点为4.36。同源性分析显示,On Xbp1-S基因与其他鱼类的聚为一支,其中,与南极鳕(Notothenia coriiceps)相似性最高。荧光定量PCR及Western-blot结果显示,On Xbp1-S在各组织中均有表达,m RNA水平上在肝脏中表达量最高,蛋白水平上在胸腺中表达量最高,而在肌肉中表达量最低。无乳链球菌应激后,On Xbp1-S基因在肝脏和脾脏中的表达趋势相似,均在应激期间出现表达量上调,在192 h出现峰值。另外,免疫组化分析发现,On Xbp1-S因子在不同分化程度B细胞亚类中的表达呈现差异,在成熟B细胞中呈现高表达,而在未成熟B细胞中几乎不表达。研究结果表明,On Xbp1-S参与尼罗罗非鱼对无乳链球菌的免疫防御,和在B细胞分化中起作用。本研究将为进一步研究On Xbp1-S因子应答病原菌侵染的机理及促进B细胞分化机制提供理论依据。     

草鱼褪黑激素受体Mtnr1基因克隆及组织表达分析

为了探究褪黑激素受体(melatonin receptor,Mtnr1)基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)中的表达模式和功能,采用RACE技术从草鱼组织中克隆获得Mtnr1基因的6个亚型(Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Alike、Mtnr1Ba、Mtnr1Bb和Mtnr1C)的cDNA序列,采用ProtParam、TMpred、NetPhos、NetNGlyc、Singal4.1及Phyre2等在线软件对Mtnr1基因的6种亚型进行生物信息学分析。同时,通过实时荧光定量PCR检测6种亚型在不同组织中的表达。结果显示,Mtnr1基因6个亚型cDNA全长分别为2045、2036、2031、2799、2535和2477 bp,分别编码350、351、344、356、347和361个氨基酸。6种亚型均由7个跨膜结构域、NRY结构域、CYICHS结构域和NAXXY结构域及G蛋白偶联受体结合位点组成,同时含有多个磷酸化位点和糖基化位点。Mtnr1基因6个亚型蛋白均由20种氨基酸组成,均属于稳定的亲水性蛋白。氨基酸序列比较分析发现,6种亚型与其他鱼对应的亚型同源性很高,分别为93.1%~99.4%、84.8%~95.2%、82.8%~96.8%、90.1%~97.5%、79.7%~98.3%和90.6%~95.6%。邻接法构建系统进化树显示,6种亚型均与鲤科(Cyprinidae)鱼类聚为一支,与鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲫鱼(Carassius auratus)和斑马鱼(Danio rerio)亲缘关系最近。此外,6种亚型mRNA在草鱼肝脏、心脏、鳃、脑、肌肉、前肠、中肠、后肠和肾脏9个组织中均有表达,其中,Mtnr1Aa和Mtnr1Ba基因分别在脑和肾脏中表达量最高,表明Mtnr1Aa和Mtnr1Ba可能在草鱼的神经调节和免疫反应中发挥重要作用。     

黄鳍鲷白细胞介素1基因原核表达载体的构建

根据黄鳍鲷白细胞介素1（interleukin-1,IL-1）基因全长cDNA序列（GenBank登录号为AY669059）设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1。以克隆载体pMD18T-IL1为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1和pQE30-mIL1。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1基因的体外重组表达研究打下了基础。     

大口黑鲈hepcidin真核表达载体构建及表达的初步研究

将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。     

尼罗罗非鱼Xbp1-S基因克隆及表达分析

为了了解尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)细胞转录因子Xbp1-S(On Xbp1-S)的基因序列特征及其在无乳链球菌(Streptococcus alactolyticus)应激和在B细胞分化中的作用,应用RACE克隆技术获得的On Xbp1-S基因全长1380 bp,包括开放阅读框ORF为1155 bp,5?端非编码区(5?UTR)长127 bp,3?端非编码区(3'UTR)长98 bp。On Xbp1-S序列分析推测该基因编码384个氨基酸,分子量为41.32 k Da,理论等电点为4.36。同源性分析显示,On Xbp1-S基因与其他鱼类的聚为一支,其中,与南极鳕(Notothenia coriiceps)相似性最高。荧光定量PCR及Western-blot结果显示,On Xbp1-S在各组织中均有表达,m RNA水平上在肝脏中表达量最高,蛋白水平上在胸腺中表达量最高,而在肌肉中表达量最低。无乳链球菌应激后,On Xbp1-S基因在肝脏和脾脏中的表达趋势相似,均在应激期间出现表达量上调,在192 h出现峰值。另外,免疫组化分析发现,On Xbp1-S因子在不同分化程度B细胞亚类中的表达呈现差异,在成熟B细胞中呈现高表达,而在未成熟B细胞中几乎不表达。研究结果表明,On Xbp1-S参与尼罗罗非鱼对无乳链球菌的免疫防御,和在B细胞分化中起作用。本研究将为进一步研究On Xbp1-S因子应答病原菌侵染的机理及促进B细胞分化机制提供理论依据。     

牙鲆rnd1基因克隆、表达模式及与抗病力的关系

迟缓爱德华氏菌病是海水鲆鲽鱼类的主要病害,发掘抗病分子标记辅助育种是十分有效的策略。本研究以牙鲆(Paralichthys olivaceus) rnd1基因(Pornd1)为对象,对该基因在牙鲆抗病免疫方面的作用进行系统分析。首先对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关单核苷酸多态性位点的定位,然后利用荧光定量PCR (qRT-PCR)对Pornd1基因的组织分布、细菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测。结果显示,Pornd1 c DNA开放阅读框为699 bp,编码232个氨基酸。结合前期GWAS分析数据,本研究对Pornd1基因扩增和测序,确定Pornd1基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关单核苷酸多态性位点,该位点在易感家系和抗病家系中分别是C/T,抗病家系(freqT=0.92)高于易感家系(freqT=0.20),具有显著性差异(P<0.05)。Pornd1在心、肝和肾中的相对表达量较高;迟缓爱德华氏菌感染后肝、肾和脾中Pornd1的表达量在6 h降低后逐渐升高,在48 h达到最高。Pornd1在抗病家系肝脏中的表达量显著高于易感家系。在蛋...     

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达

LrrG和表面免疫原性蛋白（Sip）是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的2种表面蛋白,具有良好的免疫原性。为获得罗非鱼无乳链球菌表面蛋白LrrG和Sip蛋白的融合蛋白,该试验采用基因拼接技术中的双酶切法分2步逐个将Sip和LrrG基因插入pColdⅡ载体中,构建原核表达载体pColdⅡ-LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21（DE3）,进行诱导表达条件的优化。结果显示,15℃、IPTG 0.5 mmol·L-1诱导9 h,目的蛋白呈可溶状态的表达量最高。Western Blot检测结果显示LrrG-Sip融合蛋白大小与预测一致（162kDa）,说明成功构建了融合基因,为罗非鱼源无乳链球菌亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

中华鳖GHITM cDNA基因克隆及表达分析

为研究GHITM基因在中华鳖(Trionyx sinensis)胚胎发育及生长中的作用,本研究通过RT-PCR和RACE方法获得了中华鳖GHITM全长cDNA序列;采用实时荧光定量PCR对GHITM mRNA组织表达及不同温度孵化胚胎发育过程中的表达特性进行分析。结果显示,中华鳖GHITM cDNA序列长度为2650 bp,开放阅读框为1050 bp,5?非编码区为123 bp,3?非编码区为1477 bp,编码349个氨基酸,编码蛋白的等电点为10.01,分子量为37.12 kDa。GHITM编码氨基酸序列由胞外区、跨膜区和胞内区组成,7个跨膜域组成跨膜区。GHITM编码氨基酸序列的同源性分析显示,中华鳖与锦龟(Chrysemys picta bellii)和绿海龟(Chelonia mydas)同属一个分支,3种鳄鱼构成一个分支,7种鸟类形成一个分支。实时荧光定量检测显示,GHITM基因在肝脏、肌肉和脑垂体中的表达水平较高,显著高于心脏、性腺、肠、肾脏和脾脏组织(P<0.05);50 g左右和500 g左右雄性个体肝脏中的GHITM基因表达量显著高于雌性个体(P<0.05);低温胁迫孵化能显著抑制胚胎肝脏中GHITM基因的表达(P<0.05)。上述研究结果表明,GHITM基因与中华鳖生长和胚胎发育密切相关,其在中华鳖胚胎中的表达受孵化温度调节。本研究为探讨中华鳖胚胎发育和生长提供理论依据。     

罗氏沼虾nanos1基因克隆、表达及亚细胞定位

为探究nanos1基因在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)生殖发育中的功能,克隆了罗氏沼虾nanos1基因,其cDNA序列全长2 811 bp,编码243个氨基酸;系统进化分析结果表明其与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的同源性最高,与鱼类的nanos1同源性较高,与哺乳类同源性较低。半定量PCR检测发现,nanos1在卵巢中特异表达。通过实时荧光定量PCR检测该基因在不同胚胎发育时期及幼体中的表达水平,结果显示：nanso1 mRNA在(卵)未受精时期表达量最高,显著高于(卵)受精期及胚胎发育各期(P<0.05);在胚胎发育期间,(卵)受精时期表达量最高,显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期(P<0.01);该基因在卵裂期的表达水平显著高于囊胚期至幼体期;而囊胚期至幼体期之间表达水平较低且无差异。原位杂交技术检测显示,nanos1 mRNA在卵原细胞及初级卵母细胞(Oc1,Oc2,Oc3,Oc4)的细胞质中表达。以上结果表明,nanos1与罗氏沼虾雌性生殖细胞发育有着密切的关系。     

中华鳖Wnt4基因克隆及表达分析

通过RACE技术成功获得中华鳖(Pelodiscus sinensis)Wnt4基因的cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR分析了该基因在不同组织、胚胎不同发育时期的表达特征以及Wnt激动剂(Wnt agonist 1)对其表达的影响。结果表明:中华鳖Wnt4基因cDNA全长2 432 bp,开放阅读框为1 095 bp,编码364个氨基酸。中华鳖Wnt4基因与海龟(Chelonia mydas)和三趾箱龟(Terrapene carolina triunguis)具有高度同源性。Wnt4基因在雌雄个体性腺中表达量最高,且雌性卵巢中表达水平显著高于雄性精巢(P<0.05)。在胚胎不同发育时期(14～21期)雌雄性之间有明显的表达差异(P<0.05),推测其参与了中华鳖性别分化的过程。Wnt激动剂能上调Wnt4基因的表达水平,此结果为中华鳖性别分化机制的研究提供了参考。     

黄鳍鲷白细胞介素1β基因2种表达载体的构建

根据黄鳍鲷白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)基因全长cDNA序列(GenBank登录号为AY669059)设计、合成1对特异性引物,扩增编码黄鳍鲷IL-1β基因前体肽的基因序列,通过T-A克隆构建了克隆载体pMD18T-IL1β。以克隆载体pMD18T-IL1β为模板,以设计合成的带酶切位点的引物分别扩增黄鳍鲷IL-1β的前体肽和预测的成熟肽基因序列,经BamHI和SalI双酶切后将其插入表达载体pQE30中,构建了原核表达质粒pQE30-pIL1β和pQE30-mIL1β。经酶切、PCR鉴定并最终通过序列测定表明,基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框都正确无误,为黄鳍鲷IL-1β基因的体外重组表达研究打下了基础。     

草鱼褪黑激素受体Mtnr1基因克隆及组织表达分析

为了探究褪黑激素受体(melatonin receptor, Mtnr1)基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)中的表达模式和功能,采用RACE技术从草鱼组织中克隆获得Mtnr1基因的6个亚型(Mtnr1Aa、Mtnr1Ab、Mtnr1Alike、Mtnr1Ba、Mtnr1Bb和Mtnr1C)的cDNA序列,采用ProtParam、TMpred、NetPhos、NetNGlyc、Singal4.1及Phyre2等在线软件对Mtnr1基因的6种亚型进行生物信息学分析。同时,通过实时荧光定量PCR检测6种亚型在不同组织中的表达。结果显示,Mtnr1基因6个亚型cDNA全长分别为2045、2036、2031、2799、2535和2477 bp,分别编码350、351、344、356、347和361个氨基酸。6种亚型均由7个跨膜结构域、NRY结构域、CYICHS结构域和NAXXY结构域及G蛋白偶联受体结合位点组成,同时含有多个磷酸化位点和糖基化位点。Mtnr1基因6个亚型蛋白均由20种氨基酸组成,均属于稳定的亲水性蛋白。氨基酸序列比较分析发现,6种亚型与其他鱼对应的亚型同源性很高,分别为93.1%~99.4%、84.8%~95.2%、82.8%~96.8%、90.1%~97.5%、79.7%~98.3%和90.6%~95.6%。邻接法构建系统进化树显示,6种亚型均与鲤科(Cyprinidae)鱼类聚为一支,与鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲫鱼(Carassius auratus)和斑马鱼(Danio rerio)亲缘关系最近。此外,6种亚型mRNA在草鱼肝脏、心脏、鳃、脑、肌肉、前肠、中肠、后肠和肾脏9个组织中均有表达,其中,Mtnr1Aa和Mtnr1Ba基因分别在脑和肾脏中表达量最高,表明Mtnr1Aa和Mtnr1Ba可能在草鱼的神经调节和免疫反应中发挥重要作用。     

斑马鱼原肌球蛋白基因克隆表达及免疫学鉴定

克隆斑马鱼原肌球蛋白的基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行鉴定。提取斑马鱼总RNA,采用RT-PCR克隆斑马鱼原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增斑马鱼原肌球蛋白基因的完整开放阅读框,连入载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导得到重组斑马鱼原肌球蛋白。重组蛋白经Ni 2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测。获得斑马鱼原肌球蛋白基因,Western-blot结果显示重组蛋白具有良好的免疫活性。本研究成功克隆并表达了斑马鱼原肌球蛋白基因,经免疫学鉴定发现其具有过敏原性。     

中华蛸糖代谢相关基因克隆及表达分析

头足类的养殖主要依赖于天然饵料, 目前无人工配合饲料可用, 这一问题成为其发展大规模养殖的制约因素, 研究中华蛸(Octopus sinensis)的糖代谢模式可为其配合饲料中碳水化合物的添加比例提供参考依据。本研究克隆了中华蛸葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose phosphate isomerase, GPI)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK) 和丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK) 3 个糖代谢酶的相关基因, 并对其表达进行了检测。结果显示, 中华蛸 OsGPI 的开放阅读框(open reading frame, ORF)1725 bp, 编码 574 个氨基酸; OsPGK 的 ORF1248 bp, 编码 415 个氨基酸, OsPK 的 ORF1683 bp, 编码 560 个氨基酸。qRT-PCR 结果显示, 这 3 个基因在不同组织/器官中均有表达, 但在脑、 消化腺和后唾液腺中的表达水平最高。3 个基因在胚胎不同发育时期皆有表达, 总体趋势是初孵幼体的表达量高于多细胞期。在幼体饥饿胁迫过程中, 随着饥饿时间的推移, 3 个基因在饥饿 2 d 后的表达水平显著降低, 紧接着在饥饿 3 d 和 4 d 后表达水平显著升高, 最后在饥饿 5 d 后的表达水平开始回落并降低。在投喂配合饲料(compound feeds)、锐齿蟳(Charybdis acuta)和沙丁鱼(Sardina pilchardus)的实验中, 与投喂 0 d 相比, 配合饲料组和沙丁鱼组在投喂 21 d 后, OsGPI、OsPGK 和 OsPK 在中华蛸消化腺的表达均有不同程度的升高, 在投喂 42 d 后, OsGPI、OsPGK 和 OsPK 的表达量出现不同程度的回落。锐齿蟳组在投喂 21 d 和 42 d 后, OsGPI、OsPGK 和 OsPK 的表达量相较投喂 0 d 时的均显著升高。OsGPI、OsPGK 和 OsPK 在胚胎发育、饥饿和不同饲料投喂过程中的表达模式说明其参与了中华蛸糖代谢过程的调节, 本研究可为中华蛸饲料的选择和配合饲料中碳水化合物的添加提供基础数据。