农业部组织开展兽医系统实验室检测能力比对工作

<正>为了加强兽医系统实验室能力建设,近期农业部组织完成了省级兽医实验室检测能力比对工作。本次比对共设置了H5亚型禽流感抗体检测、O型口蹄疫抗体检测和高致病性猪蓝耳病病毒检     

新疆巴州地区牛细小病毒流行病学调查

为了解巴州地区牛细小病毒的流行情况,随机抽检临床表现正常的80头奶牛、80头牦牛和80头肉牛的血清以及相应的粪便样品,抽检发病(流产母牛和腹泻犊牛)的57头奶牛、52头牦牛和46头黄牛的粪便样品,采用ELISA、PCR方法分别检测血清、粪便中细小病毒的抗体、核酸。结果发现:正常的奶牛、牦牛和肉牛细小病毒抗体阳性率分别为51.3%、31.3%、46.3%,核酸阳性率分别为3.8%、0%、0%,奶牛细小病毒抗体阳性率显著高于牦牛抗体阳性率;发病奶牛、牦牛和黄牛细小病毒核酸阳性率分别为17.5%、3.8%、10.9%,犊牛核酸阳性率(17.3%)显著高于成年牛阳性率(5.0%),奶牛核酸阳性率显著高于牦牛核酸阳性率。说明巴州地区牛存在细小病毒感染,不同品种牛感染有差异,成年牛和犊牛感染有差异。     

禽流感的诊断技术研究

禽流感可感染人类,公共卫生意义重大。由于其病毒(AIV)亚型众多,抗原性变异极快,毒株的致病性也相差很大,早期快速诊断和血清学监测就成了预防和控制禽流感的前提条件。禽流感的传统诊断方法是分离病毒和检测抗体,近年来,AIRC相继建立了血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验(AGP)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、玻片血凝抑制试验等血清学诊断技术及分子诊断技术(RT-PCR)。目前,我国专家研制成功了“禽流感H5,H7,H9亚型多重实进荧光RT-PCR检测试剂盒”,可在4h之内同时检测3个AI亚型,满足了对AI疑似病例的快速确诊需要。     

爆发高致病禽流感疫区的自主活动鸟类禽流感及新城疫的血清学调查与分析

应用血凝抑制试验(HI),对采自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中的54份血清血清学检测,分析结果显示,在总共采集的54份血清样品中,抗新城疫病毒(NDV)抗体流行血清型(seroprevalence)与抗H6亚型禽流感病毒(H6)抗体、抗H9亚型禽流感病毒(H9)、抗H5亚型禽流感病毒(H5)抗体阳性率分别为64.8%、75.9%、29.6%。而根据血凝抑制试验检测结果发现,H5亚型禽流感病毒抗体滴度较低,最高仅为320,其阳性率为29.6%,推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒,可能为与该次流感爆发相关的新病毒,这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证;新城疫病毒在该生态系中的稳定循环,构成了对家禽潜在的威胁,我国目前非典型新城疫的一个主要原因是带毒鸟类的传入。     

野生水禽高致病性禽流感卵黄抗体监测

为了解野生水禽对高致病性禽流感病毒(AIV)自然被动免疫状况,于2010—2011年,在大庆龙凤湿地分别采集绿头鸭、须浮鸥、黑翅长脚鹬三种野生水禽巢卵150、184和128枚,采用血凝抑制试验检测H5和H7两种AIV的卵黄抗体。结果表明,绿头鸭H5和H7亚型禽流感卵黄抗体的阳性率分别为53.33%和14.67%,平均卵黄抗体滴度分别为4.55和3.45(log2);须浮鸥H5和H7亚型禽流感卵黄抗体的阳性率分别为34.78%和11.96%,平均卵黄抗体滴度分别为3.78和3.18(log2);黑翅长脚鹬H5和H7亚型禽流感卵黄抗体的阳性率分别为31.25%和9.38%,平均卵黄抗体滴度分别为3.85和3.67(log2)。由此可见,野生水禽种群对于高致病性禽流感的接触情况是较为频繁的,提示需要进一步加强对其种群的病毒携带情况进行监测。     

猪瘟病毒实验室诊断研究进展

猪瘟的实验室诊断中,主要有针对病毒抗原、抗体及分子生物学检测三大类方法。病原检测方法有免疫组化法、酶联免疫吸附试验(ELISA法)、免疫金标记技术等;抗体检测有免疫荧光中和试验(IFCNT)、间接血凝试验(IHA)等;分子生物学检测有反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。     

县级兽医系统实验室的现状调查

兽医系统实验室是疫控系统的重要技术力量。通过对县级兽医实验室在实验室建设、管理运行、检测能力、仪器设备和人员等方面的调查,发现了县级兽医实验室的不足,并提出了相关建议。     

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。     

IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

试验建立了IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法,并进行了验证。经试验研究,封闭液用1.5%Casein酪蛋白、包被液用0.02M的PB溶液、包被浓度为1/1 000,酶标单抗浓度为1/1 000,酶稀释液为小反刍酶稀时,该IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的灵敏度和稳定性最佳,此时的板内变异系数为7.7%,板间变异系数为9.41%,均低于10%,且热稳定性良好。试验建立的竞争ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏度,可用于IBR病毒抗体的检测。     

PCR-DHPLC检测方法在病毒性出血性败血病诊断中的应用

运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方法进行平行检测。结果表明,该方法与荧光RT-PCR检测结果相同,其特异性强,灵敏度较高,检测限为3 pg的病毒核酸模板,PCR-DHPLC技术具有高通量、自动化程度高等优势,是一种快速有效的检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测中包被抗原的研究

目的研究不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白对PRRSV抗体ELISA检测效果的影响。方法将PRRSV重组N蛋白、M蛋白和CGP5蛋白3种蛋白抗原单独包被,灵敏度分别为85.0%、60.0%、50.0%。为进一步优化ELISA检测方法 ,以N蛋白为主包被蛋白,M蛋白和GP5蛋白以不同的比例混合包被,研究最佳包被条件。结果当N蛋白、M蛋白和GP5蛋白以5ng:5ng:5ng/孔包被时,敏感性和特异性均达到100%,混包效果优于抗原性蛋白单独包被。为今后PRRSV抗体ELISA检测试剂的进一步研制奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒873株逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

为提高草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)的检测效率,根据GCRV-873株VP5基因片段,设计了2对特异性引物,建立了检测GCRV-873株的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。结果显示:该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,比传统的RT-PCR方法要高10倍。且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见,是一种特异性强、方便快捷的检测方法,适合GCRV-873株的现场初筛和核酸检测工作。     

草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果

将草鱼呼肠孤病毒( GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71 -VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果.重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30 μg空载体组及对照组.于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果.结果显示,pFastBac-β-VP71 -VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录;各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60 μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0％、0％、5％,而空载体组和对照组分别为30％和100％,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果.研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础.     

用RT-套氏PCR ELISA检测新城疫病毒

马来西亚研究人员研制了一种用敏感和特异的RT-套氏PCR结合ELISA检测系统检测新城疫病毒NDV的方法。从一致融合基因顺序设计了对所有3个致病型NDV都高度特异的两个套氏引物对。与其他禽传染性病原体没有交叉反应,包括传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒和禽痘病毒。根据琼脂糖电泳检测,这种RT-套氏PCR的敏感性比非-套氏RT-PCR高约100倍。为了检测PCR产物,研制了一种ELISA检测法可以检测扩增的PCR产物并证实其敏感性是凝胶电脉的10倍。还通过对从有ND症状鸡收集的35份样品进行测试,比较了这种套氏PCR-ELISA与常规NDV检测方法HA试验和非-套氏RT-PCR的效果。用这种RT-套氏PCR ELISA发现21份60%组织样品NDV阳性,而用非-套氏RT-PCR和常规HA试验分别只有8份(22.9%)和2份(5.7%)NDV阳性。由于其检测组织样品中的NDV高度敏感,可以用这种PCR-ELISA诊断试验筛选大量样品。     

三黄鸡免疫重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗抗体检测实验探讨

为进一步了解三黄鸡免疫重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活苗的免疫效果。随机选取了4个三黄鸡养殖培育场开展了三价灭活疫苗以及血清保护作用的抗体蛋白质检测实验。通过实验不仅能够进一步了解三黄鸡养殖培育场的H5及H7亚型禽流感的抗体水平,还能够根据检测结果,进一步认知抗体消长规律,从而指导养殖场制定合理的免疫程序,为有效地防控禽流感的发生以及流行提供参考。     

口蹄疫病毒O型抗体直接竞争ELISA检测方法研究

目的建立一种敏感、特异、快速的O型口蹄疫病毒抗体检测方法。方法以O型口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1和HRP标记VP1兔抗血清为原料,通过方阵滴定试验确定ELISA的反应条件以及阈值,建立直接竞争ELISA检测方法 ,并运用该方法检测已知临床阴阳性样品。结果 VP1抗原包被浓度为50ng/μL;HRP标记抗血清工作浓度为1:2000;抑制率大于30%为阳性,抑制率小于30%为阴性;检测120阳性临床血清,阳性检出率为90.8%;检测120份阴性临床血清,阴性检出率为93.3%。结论研究建立的直接竞争ELISA方法操作简单,能够用于检测口蹄疫病毒O型抗体VP1抗体。     

传染性造血器官坏死病病毒参考蛋白的研制

为规避活病毒作参考物质存在的生物安全风险,本研究利用毕赤酵母表达系统表达了传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的糖蛋白来制备参考蛋白,作为IHNV免疫学检测参考物质。本研究选用IHNV糖蛋白基因(IHNV-G)为目的基因,根据Gen Bank中IHNV全基因序列设计特异性引物,以IHNV-uk株病毒核酸为模板,通过RT-PCR获得糖蛋白基因片段,将其克隆至真核表达载体p PICZαA,转入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使外源基因与酵母基因融合,通过1%甲醇诱导表达外源蛋白,SDS-PAGE分析显示获得可溶性表达蛋白,分子量大于70 ku。经Western Blot和ELISA分析,该表达产物可以被IHNV多抗特异性识别。0.1531 mg的重组蛋白与0.3125TCID50 IHNV在ELISA实验中反应原性相当,–20°C可稳定保存2个月,说明其在一定程度上可替代病毒作为参考物质。该研究为IHNV ELISA检测试剂盒的开发奠定基础。     

H5亚型禽流感灭活油乳剂疫苗对鸭的免疫试验

H5亚型禽流感(AI)油乳剂灭活疫苗接种成年鸭和幼鸭后,用ELISA法检测抗体消长规律,结果表明,AIVH5亚型灭活油乳剂疫苗两次接种可以有效地预防成年鸭,而一剂H5亚型AIV灭活油乳剂疫苗接种幼鸭后的免疫应答反应不好。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SCQ株的分离鉴定

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属,是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一。本研究以出现繁殖障碍的母猪并通过ELISA检测为抗体阳性者的血清为材料,于2000年首次从重庆地区分离出PRRS病毒。母猪血清接种Marc-145单层细胞,经盲传至第四代时出现典型的细胞病变效应(CPE);细胞培养物经电镜观察,发现其中有球形的病毒粒子,粒子大小为40～80nm,核心直径为20～40nm;病毒TCID50为10-4.46/0.05mL;用抗PRRSV特异性抗体能特异地中和病毒,中和指数为100,并将该地方分离株命名为PRRSV-SCQ株。根据Genbank中PRRSV北美洲株ATCCVR-2332的序列设计一对特异性引物,以PRRSV-SCQRNA为模板,通过RT-PCR扩增其GP5基因片段,并将该片段插入克隆载体pMD18-T的EcoRV位点;测序结果表明该GP5基因序列与PRRSV-VR2332、LV株的GP5基因核苷酸序列同源性分别为99.34%和62.14%,GP5蛋白氨基酸推导序列的同源性分别为97.51%和54.37%,揭示SCQ地方分离株与VR2332株在基因型上更为接近,应属于美洲型。     

现代生物技术检测对虾病毒在商业化应用中的限制

对虾病毒性疾病有多种,如白斑病毒、桃拉病毒、黄头病毒等。多年来,科研人员对病毒病的诊断方法进行了大量的研究,现代生物检测技术得到较多应用,如酶联免疫吸附(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针斑点杂交等．发表了较多提取病毒、改进病毒检测方