基于转录组测序的象耳豆根结线虫致病相关基因初步筛选

[目的]象耳豆根结线虫具有致病力强、分布范围广、危害严重、且能克服多数栽培作物中的抗根结线虫基因抗性的特性,为了探究象耳豆根结线虫克服抗线虫基因抗性的机制,本研究以象耳豆根结线虫与携带Mi-1基因番茄的互作为研究对象。[方法]将象耳豆根结线虫接种番茄VFNT植株,运用转录组测序技术比较分析象耳豆根结线虫侵染番茄根系2～6 d关键时期基因转录情况,筛选差异表达基因并对上调基因进行功能和代谢通路的分析,再利用生物信息学软件筛选出具有信号肽且无跨膜结构域的象耳豆根结线虫候选致病相关基因,并进行qPCR试验验证。[结果]象耳豆根结线虫侵染后在侵染前期差异表达基因共计967个,其中上调基因647个;差异上调基因功能及代谢过程都有明显变化且多与侵染相关,通过生物信息学分析发现其中的29个基因符合线虫致病相关基因特征,结合基因序列比对及结构域分析从中挑选出信度最高的5个基因,qPCR验证上述5个基因均在象耳豆根结线虫寄生关键阶段特异性上调表达。[结论]通过象耳豆根结线虫侵染携带番茄VFNT植株转录组进行分析从而初步筛选致病相关基因,为进一步了解象耳豆根结线虫强致病机理和制定相关防治策略奠定了基础。     

南方根结线虫对不同寄主植物侵染能力的比较

[目的]筛选南方根结线虫的易感寄主。[方法]通过接种试验比较了南方根结线虫对5种寄主植物（黄瓜、番茄、茄子、菠菜及辣椒）的侵染能力。[结果]南方根结线虫对不同寄主植物的侵染能力存在显著差异。黄瓜和番茄的根结百分率显著高于菠菜、茄子和辣椒,黄瓜和番茄根际土壤中2龄幼虫数、雌成虫数及卵块数都显著高于菠菜、茄子和辣椒。[结论]南方根结线虫对黄瓜和番茄的侵染能力显著强于菠菜、茄子和辣椒,为南方根结线虫的易感寄主植物。     

Hsp90基因在南方根结线虫和番茄中的表达研究

Hsp90基因是真核生物中广泛存在且非常保守的热激蛋白基因家族中的重要成员,在生物的抗逆胁迫过程中起重要作用.从番茄基因组扩增Hsp90基因,连接到载体pCAMBIA1302上,构建了表达载体pCAM-Hsp90,利用实时定量荧光技术检测了番茄接种南方根结线虫后Hsp90基因的表达水平,结果表明:在20～25dpi后番茄根部SI-Hsp90基因大量表达.此外,南方根结线虫的雌虫和二龄幼虫J2的Mi-Hsp90基因在高温和低温胁迫时表达量都高于对照,而且在35℃时表达量要高于4℃时的表达量,在J2中的表达量高于雌虫的表达量.说明Hsp90基因在番茄抗线虫侵染以及线虫适应环境方面起到非常重要的作用.南方根结线虫J2在35℃高温下Hsp90的高表达使其能够保持较高的活力并侵染番茄的根部,从而使南方根结线虫更适合在较高温度下生存.本试验进一步证明热激蛋白在番茄抗线虫侵染和线虫对环境的适应性过程中起到重要作用,同时为利用生态控制的方法防治根结线虫病害提供理论依据.     

合肥地区南方根结线虫入侵对番茄青枯病发生的影响

[目的]为合肥地区的番茄根结线虫病和青枯病的防治提供理论依据。[方法]选用西粉3号番茄在试验基地进行基质栽培试验,从青枯病发病率的差异和相对电导率的差异的角度,探讨根结线虫的入侵对青枯病发生的影响,并对合肥地区侵染番茄的根结线虫进行鉴定。[结果]当南方根结线虫与青枯菌同时入侵番茄时,青枯病的发病率在70%～100%;而没有根结线虫入侵,青枯病的发病率仅为30%。[结论]合肥地区侵染番茄的根结线虫为南方根结线虫。在生产上,有根结线虫存在的田块,在进行番茄青枯病的防治时,应考虑到根结线虫的防治。     

保护地番茄根结线虫的病原鉴定及抗性材料筛选

以根结线虫病样、番茄品种及组合为试材,采集包头市根结线虫暴发地一个根结线虫病样,进行形态学和分子生物学鉴定;利用PCR技术对24个番茄品种及组合进行Mi-1基因扩增筛选.结果表明,感染内蒙古包头市番茄的根结线虫为南方根结线虫;筛选出3个纯合抗根结线虫番茄组合.抗感品种及组合均产生750 bp的特异片段,纯合抗病基因的番茄组合存在TaqⅠ酶切位点,酶切后产生了570和160 bp特异性片段,为防治当地番茄根结线虫及培育抗病品种积累材料.     

番茄品种Mi基因对根结线虫抗性的检测

采用酶切扩增多态性序列(Cleaved amplified polymorphic sequences,CAPS)方法对国内市场上的26个番茄Solanum lycopersicum品种进行Mi基因检测.结果表明,特璐丝、红丽、TRS-401、仙客1号和仙客5号5个品种含有纯合体Mi基因,其余品种均不含Mi基因.进一步用南方根结线虫Meloidogyne incognita和象耳豆根结线虫M.enterolobii对这26个品种进行接种试验,计算根结率和根结指数.结果发现,南方根结线虫和象耳豆根结线虫侵染不含Mi基因的21个番茄品种的根结率为100%,根结指数为100;而含Mi基因的5个番茄品种对南方根结线虫的根结率为1%~5%,根结指数为0~4,而对象耳豆根结线虫的根结率为26.7%~45.6%,根结指数为56~64.表明含Mi基因的番茄高抗南方根结线虫,但对象耳豆根结线虫感病或比较感病.     

辣椒种质对南方根结线虫抗性的鉴定

[目的]筛选高抗南方根结线虫辣椒种质材料,为辣椒抗病育种提供抗源.[方法]通过测定67份辣椒种质接种南方根结线虫50 d后的相关抗病指标,利用聚类分析和隶属函数运算相结合的方法进行综合分析.[结果]南方根结线虫对不同辣椒种质相关抗病指标的影响显著不同,卵粒指数和根结指数存在丰富的遗传变异,变异系数分别为143.16％和118.95％.以根结指数为统计参数对供试辣椒种质进行聚类分析,可将67份供试辣椒种质材料分为抗病、中抗、感病和高感4类.根据抗病指标隶属函数总值,确定了供试辣椒种质抗南方根结线虫的顺序.其中,Rela 2和L506M隶属函数总值最高,达2.00,表明其对南方根结线虫表现免疫,L287-2、L522-1M、L504M、L515-2、13SM100-1、L512M、L292-1、L319、L316、L317、13SM87-1和Rela 5的隶属函数总值均超过了1.95,对南方根结线虫表现高抗.[结论]该研究为辣椒根结线虫抗性育种提供了抗源.     

猕猴桃根结线虫形态观察与病原鉴定

[目的]明确贵州猕猴桃根结线虫的种类,为猕猴桃根结线虫病的防治提供理论依据.[方法]从贵州省修文、息烽和大方县采集感染根结线虫的猕猴桃植株,利用改良的贝曼漏斗法分离根结线虫,采用显微镜和扫描电镜对猕猴桃根结线虫进行形态观察与测量,结合分子生物学方法对线虫进行鉴定.[结果]猕猴桃根系被根结线虫侵染后产生根结或瘤状物,形成大小不等的根瘤,直径为0.5~1.0 cm;直径1.5~2.0 mm的须根受害较重,被侵染的须根产生单个或串生结节状肿瘤,瘤状物呈椭圆或近球形.猕猴桃根结线虫雌虫的排泄孔至头端的距离是口针的1倍左右,口针微微向背部弯曲,唇盘呈哑铃状,侧唇与中唇和唇盘分开,分界明显;雄虫唇盘大而圆,比中唇高,中唇外围圆滑,与唇盘分界明显.猕猴桃根结线虫种群与GenBank的南方根结线虫MK784570、KP234265和KF041336等线虫的序列相似度达99%.[结论]侵染贵州省修文、息烽和大方县猕猴桃的根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita).     

番茄NBS LRR抗根结线虫基因同源序列的克隆与分析

根据已知抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,从抗南方根结线虫病的番茄材料cDNA中克隆抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),并通过qRT-PCR技术检测RGAs与南方根结线虫侵染的相关性。序列分析发现,2条序列具有NBS-LRR保守结构域,分别命名为F5-8和F5-20;保守区域氨基酸比对结果显示,F5-8(GenBank登录号为MG860907)和F5-20(GenBank登录号为MG860908)与已知抗病基因保守区域具有很高的相似性,其中F5-8与Mi-1相应区域氨基酸相似性为94%,F5-20与Hero基因相应区域氨基酸相似性为96%。qRT-PCR结果发现,F5-8和F5-20在接种南方根结线虫2龄幼虫24h后其表达量均发生了变化。初步推测F5-8和F5-20为南方根线线虫侵染相关基因同源序列。     

番茄砧木对南方根结线虫抗性鉴定

 【目的】研究确定准确鉴定评价番茄砧木抗南方根结线虫侵染能力的方法,筛选抗性砧木材料。【方法】通过测定16个盆栽番茄砧木幼苗接种南方根结线虫50 d时的相对生长量及相关抗病指标,利用系统聚类分析和隶属函数运算相结合的方法进行综合分析。【结果】南方根结线虫侵染对不同番茄砧木幼苗各器官相对生长量、相关抗病指标及其变异系数的影响显著不同,其中生长量的变异系数以相对根鲜质量较大,为20.20%,相对茎粗较小,仅6.22%。采用相对生长量及抗病指标分别进行系统聚类的结果与利用根结指数的聚类结果一致,但与病情指数的聚类结果存在些微差异。根据综合指标隶属函数运算,确定了供试番茄砧木抗南方根结线虫的顺序。【结论】采用多指标综合聚类分析较单一指标聚类分析更能准确划分番茄砧木抗根结线虫的类群,通过聚类分析和隶属函数相结合的方法,确定Bパリア为免疫材料,BESUPA、坂砧2号、砧木606、砧木002、砧木001、TMS-150、サポ-ト、MIKADO、砧木401为抗病材料,アンカ-T为耐病材料,坂砧1号、北京1号为感病材料,128、BF兴津101、LS-89为高感材料。     

云南省部分烟区根结线虫形态和分子鉴定

[目的]明确当前云南省部分烟草种植区根结线虫的种类和分布,为烟草根结线虫病综合防治及烟草品种布局提供理论依据.[方法]2015年8~10月,在云南省主要烟草种植区昆明、曲靖和玉溪市采集54份烟草根结线虫病根样本,采用雌成虫会阴花纹形态观察及分子生物学检测(rDNA-ITS区和SCAR特异性鉴定)对病原根结线虫种类进行鉴定.[结果]采集的54份样本中有24份样本的病原为花生根结线虫(Meloidogynearenaria),占44.44%;7份样本为南方根结线虫(M.incognita),占12.96%;1份样本为爪哇根结线虫(M.javanica),占1.85%;11份样本为爪哇根结线虫和花生根结线虫的复合种群,占20.37%;5份样本为南方根结线虫和花生根结线虫的复合种群,占9.26%;3份样本为南方根结线虫和爪哇根结线虫的复合种群,占5.56%;3份样本为南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种线虫的复合种群,占5.56%.[结论]当前危害云南省部分烟草种植区(昆明、曲靖和玉溪烟区)的根结线虫种类主要有南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫3种,以花生根结线虫为优势种群.     

南方根结线虫侵染对不同烟草品种生理生化指标的影响

为烟草抗南方根结线虫育种研究提供科学依据,在盆栽条件下,采用人工接种方法研究不同抗性烟草品种受南方根结线虫侵染后其根系生理生化指标的变化规律。结果表明:受南方根结线虫侵染后,抗病烟草品种G28根系的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)总体活性和在2次侵染前期酶活的增加幅度均较感病品种长脖黄大,但超氧化物酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量均低于长脖黄。较高的PAL、TAL、POD和CAT活性能提高烟草抗南方根结线虫能力。     

广西桑寄生线虫调查初报

[目的]对广西桑主产区的桑根际寄生线虫种类进行调查,了解广西桑区线虫病发生情况、线虫种类及其分布,为桑树线虫病害防治提供科学依据.[方法]在广西桑主产区宜州、象州、横县桑田采集桑根系和根际土壤,根据形态特征和形态测量值进行寄生线虫鉴定.[结果]共鉴定出9个属4种植物寄生线虫,分别为:南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、异螺旋线虫(Helicotylenchus exallus)、畸形小环线虫(Criconemella informis、针线虫(Paratylenchus sp.)、喜悦平滑垫刃线虫(Psilenchus hilarulus)、丝尾垫刃线虫(Filenchus sp.)、矮化线虫(Tylenchorhynchus sp.)、真滑刃线虫(Aphelenchus sp.)和细针线虫(Gracilacus sp.),其中以南方根结线虫最普遍,平均每100 mL土中有123.0头2龄幼虫.[结论]广西桑寄生线虫以南方根结线虫为优势种,生产中应对南方根结线虫予以重视,并制定相应的防治措施控制病害的发生.     

新型鸡粪发酵提取液对番茄生长及根结线虫病的影响

[目的]研究鸡粪发酵提取液对番茄生长及根结线虫病防治效果的影响,为科学利用鸡粪防治作物根结线虫病提供参考.[方法]设5、10、25、50、100、300、500和1000倍8个稀释倍数的鸡粪发酵提取液处理,以清水为对照,通过浇灌已接种南方根结线虫的盆栽番茄,研究其对番茄植株生长及根结线虫病防治效果的影响;通过室内培养2龄根结线虫和根结线虫卵,研究不同稀释倍数的鸡粪发酵提取液对根结线虫致死和根结线虫卵孵化的影响.[结果]50、100和300倍鸡粪发酵稀释液更有利于番茄植株前期生长;5、10和25倍鸡粪发酵稀释液更有利于番茄植株后期生长,且能显著降低根结线虫发病率,最高防效达72.7%.培养试验结果表明,5、10和25倍鸡粪发酵稀释液能显著抑制根结线虫卵孵化,抑制率在70.0%以上;5和10倍鸡粪发酵稀释液对根结线虫的致死作用明显,处理后24 h即达到100.0%的致死效果.[结论]5~10倍稀释的新型鸡粪发酵提取液能促进番茄植株生长,显著抑制根结线虫卵的孵化,杀死2龄线虫,减少根结线虫病的发生,是一种操作简便且环保安全的根结线虫病防治方法.     

胚挽救和分子标记辅助筛选获得番茄抗根结线虫杂种

为获得番茄抗根结线虫杂种,以含有温度敏感型抗根结线虫Mi-1基因的高代优良自交系栽培番茄(Lycopersicon esculentum)5678161"为母本,与含有非温度敏感型抗根结线虫Mi-3基因的秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)LA2823"为父本进行杂交,通过胚挽救技术获得10个胚挽救苗株系;应用序列相关扩增多态性(SRAP)分子标记技术对胚挽救苗进行亲子鉴定,证实杂种的真实性;利用Mi-1和Mi-3基因的特异引物对杂种植株进行分子检测,从杂种中检测出拥有Mi-1基因标记的后代10株,同时拥有Mi-1和Mi-3基因标记的后代1株.     

TRV介导的E3泛素连接酶基因NbE3R14沉默对烟草基础免疫及南方根结线虫寄生的影响

[目的]本文旨在研究E3泛素连接酶基因的沉默对植物基础免疫及线虫寄生的影响,为揭示植物寄生线虫侵染寄主的分子机制提供理论依据。[方法]利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟E3泛素连接酶基因NbE3R14,用flg22处理基因沉默烟草叶片,RT-qPCR检测PTI(病原相关分子模式触发免疫,PAMPs-triggered immunity)相关基因的表达水平;接种辣椒疫霉于基因沉默烟草叶片,观察叶片病斑症状;采用室内人工接种法测定靶基因的沉默对南方根结线虫寄生的影响。[结果]RT-qPCR检测显示:农杆菌转化的烟草植株中NbE3R14基因已被成功沉默,flg22处理基因沉默烟草叶片激发的PTI相关基因GRAS2、WRKY7及WRKY8表达量分别下降41.3%、63.9%及61.8%,与野生型对照(WT)相比均有显著性差异(P0.05);接种辣椒疫霉36 h后,TRV∷NbE3R14处理烟草叶片的病斑比WT增大28.5%;南方根结线虫在TRV∷NbE3R14处理植株上产生的根结数、雌虫数及卵块数与WT相比分别显著增加22.1%、27.4%和17.2%(P0.05),单卵块卵量则没有差异;而在TRV∷GFP处理植株上产生的根结数、雌虫数、卵块数以及单卵块卵量与WT均无明显差异。[结论]沉默NbE3R14基因能干扰植物基础免疫,从而导致烟草对辣椒疫霉及南方根结线虫的侵染更为感病。     

番茄响应南方根结线虫侵染相关转录因子的初步分析

为明确番茄接种根结线虫后基因种类和表达量在转录水平的变化规律，利用RNA-seq对未接种及接种南方根结线虫2龄幼虫6、12、24和48 h的番茄进行转录组测序，探究番茄响应南方根结线虫侵染相关的关键转录因子，并采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。结果显示，接种南方根结线虫后6、12、24和48 h分别有350、390、580、1 154个基因差异表达，其中差异表达转录因子分别为11、11、19、50个。这些转录因子属于15个家族，其中数量最多的为MYB家族和bHLH家族（均为20个），其次是ERF家族19个、WRKY家族15个、bZIP家族9个。南方根结线虫侵染过程差异表达最明显的主要为ERF、WRKY、MYB和bHLH家族转录因子，其中Solyc03g005520、Solyc02g094270和Solyc09g066350显著上调，接种后48 h log₂FC分别为 9.16、6.49和6.33；Solyc02g079280、Solyc12g100140 和Solyc04g072460显著下调，接种后48 h log₂FC分别为-2.60、-1.72和-1.70。qRT-PCR验证结果显示，6个随机选取基因的表达趋势与测序结果基本一致。以上结果表明，ERF、WRKY、MYB和bHLH家族转录因子可能参与番茄与南方根结线虫互作，在番茄响应南方根结线虫侵染反应中发挥着重要的调控作用。     

番茄抗根结线虫接种鉴定技术及其应用

用3个番茄抗线虫品种和两个感线虫品种作为试验材料,对北京地区危害番茄的南方根结线虫进行 苗期人工接种鉴定,研究结果表明,采用灌根接种法,适宜的接种体浓度为2000卵／株,适宜的接种苗龄为10 ～20 d,供试3种栽培基质培育的幼苗对接种效果没有明显影响,接种后30 d进行调查即可明显区分出不同 番茄品种对根结线虫的抗、感差异。运用该方法对28份番茄育种材料进行抗线虫评价,筛选出对线虫免疫的 材料8份,高抗线虫的材料12份,抗线虫材料3份,感病材料5份,其中抗线虫材料占82．1％,说明番茄蕴藏着 丰富的对改良线虫抗性有利用价值的基因资源。     

番茄种质材料对南方根结线虫抗性鉴定

采用盆栽接种2龄幼虫法,对4份番茄种质材料进行抗南方根结线虫鉴定,并对其有关生理生化指标进行观测。结果显示,番茄种质材料无限生长（红色）和Bss368对南方根结线虫表现为抗性,红吉星和大明星表现为感病,具体表现为抗性材料根际线虫量及根结数比感病材料少,根际线虫高峰期比感病材料晚;感病材料地上部分生长受抑制明显,根冠比高于抗病材料;抗病材料过氧化物酶（POD）活性高,积累量大,能及时阻止线虫的侵染。     

南方根结虫寄生相关基因研究进展

南方根结线虫在世界范围内广泛分布,在最低温度高于3℃的每个国家都有发现.它能侵染几乎所有农作物的根系因此成为最具破坏力的作物病原物.每年造成的经济损失高达1000亿美元.尽管杀线虫化学药剂是控制南方根结线虫最有效的方法,但因其对人类和环境的毒性而逐渐被弃用.因此研究工作的重点转向研究南方根结线虫寄生相关基因及其产物上.这些研究有助于深入了解其成功寄生和突破植物免疫防御的机理.综述了南方根结线虫寄生相关基因及其产物的研究进展,并对使用RNAi技术防治南方根结线虫的策略进行了评估.