生长素结合蛋白ABP1研究进展

就生长素结合蛋白在植物体内的分布、结构和性质、亚细胞定位及其受体功能的研究概况作了简要介绍。     

苎麻生长素结合蛋白BnABP1与GFP融合在烟草中的表达

运用已克隆的苎麻生长素结合蛋白BnABP1基因cDNA及植物表达载体pCAMBIA1300 GFP,构建了35S启动子控制的苎麻BnABP1基因编码区段与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达重组体(pCAMBIA1300 GFP BnABP1)。通过根癌农杆菌介导法将其转化烟草WS38,经抗性筛选和PCR检测获得了转基因烟草。对转基因烟草细胞进行荧光显微镜观察,发现在细胞质膜和内膜系统上都有较强烈的荧光信号,进一步证明苎麻生长素结合蛋白ABP1已结合在细胞的膜系统上。     

甘蓝纤维素合成酶基因BoCesA的克隆与序列分析

为研究甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因在干旱胁迫下的表达模式,通过同源克隆得到甘蓝纤维素合成酶基因的cDNA全长,利用生物信息学软件分析该基因的特征;构建含BoCesA和GFP的融合表达载体,通过基因枪转化洋葱表皮细胞试验对该基因进行亚细胞定位;利用荧光定量PCR分析基因在不同组织中的表达情况及干旱胁迫下的表达模式。甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因的cDNA全长为2 721bp,编码906个氨基酸,在N端含有锌指结构域和2个跨膜区,C端含有6个跨膜区,除包含植物纤维素合成酶基因共有的保守区外,还包含2个高突变区。通过氨基酸序列比对分析,发现甘蓝的该基因与拟南芥的AtCesA3基因同源性较高。亚细胞定位表明BoCesA基因初步定位于细胞质膜上。荧光定量PCR分析表明该基因在叶中的表达量高于茎和根中的表达量,在NaCl、PEG处理下BoCesA表达量呈现先升高后下降的趋势。通过对甘蓝纤维素合成酶BoCesA基因在NaCl、PEG胁迫下的表达分析,预测该基因对干旱胁迫有响应,它的表达受干旱胁迫的影响,这为进一步研究基因功能奠定了基础。     

拟南芥Ran小GTP结合蛋白在细胞有丝分裂中的定位

分别采用RT-PCR和直接荧光免疫方法分析Ran2 mRNA在拟南芥不同组织器官中的表达及Ran2的亚细胞定位。结果表明,Ran2基因在拟南芥根、茎、叶和花中均有表达;Ran2蛋白在细胞分裂间期主要定位于核膜周边,在后期定位于赤道板上和纺锤体上,末期又回到子细胞核膜周边。     

生长素结合蛋白ABP1基因在棉纤维伸长中的功能

以‘湘杂棉14’为材料,采用RT–PCR方法克隆了棉花ABP1基因全长cDNA序列。序列全长792 bp,与GenBank中陆地棉ABP1基因序列的同源性为99%。半定量分析表明,该基因在棉花叶、花及纤维中都有表达,其中叶中的表达量最高,花和纤维中的表达量稍低。ABP1基因在纤维快速伸长期表达水平较高,纤维发育的其他时期的表达水平较低。将ABP1基因cDNA构建成棉花ABP1过表达载体,并以NPT II作为选择标记,经农杆菌介导转化棉花,获得了6株Kan抗性植株,其中3株ABP1表达水平提高。ABP1过表达植株生长发育正常,但纤维长度变化不显著,说明ABP1棉纤维细胞中提高表达水平对其细胞伸长没有显著作用。     

生物信息学技术分析并克隆超级稻生长素结合蛋白cDNA

为进一步研究超级稻的生长素结合蛋白,采用生物信息学方法获得其全长cDNA序列,并进行分析;对全长序列进行了全长验证.从数据库搜索获得了一条水稻cDNA序列,含一个推测的206个氨基酸的开放阅读框,与其它植物的ABPIcDNA序列和ABPI蛋白质序列具有明显的同源性,并且其推测编码的蛋白质的各种性质,类似于其它植物的ABPI.结果显示,该序列为水稻的ABPIcDNA.以该序列为指导,利用RT-PCR扩增超级稻ABPlcDNA,并克隆测序,其序列与电子搜索结果一致.     

杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析

纤维素合成酶类似蛋白(CSL)作为一种重要的膜蛋白与纤维素合成酶具有相类似的蛋白结构,都含有D,D,D,QXXRW保守区.利用其他物种中的CesA基因的保守序列设计简并引物,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)成功地从杉木Cunninghamia lanceolata中扩增出一个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为4 150 bp,开放阅读框架为3 396 bp,编码1 132个氨基酸并含有保守的D,D,D,QXXRW天冬氨酸残基序列.应用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库对获得的基因进行序列分析比对,发现它属于CslD基因家族,命名为ClCslD1基因.多重序列比对结果分析表明,该蛋白与来自颤杨Populus tremuloides,水稻Oryza sativa,拟南芥Arabidopsis thaliana等的同源基因相似性高达71％以上.利用生物软件对其进行生物学分析,为进一步研究其在植物纤化中的功能奠定基础.     

棉花与拟南芥纤维素合成酶基因家族的生物信息学比较

为给克隆到的棉花纤维素合成酶CesA基因的功能分析提供参考,采用生物信息学、基因保守结构域搜索、聚类分析和电子拼接技术,分析了拟南芥和棉花纤维素合成酶在基因组上的分布,预测了从棉花中克隆到的纤维素合成酶CesA基因的功能.结果表明:棉花中克隆的纤维素合成酶基因与拟南芥纤维素合成酶基因参与纤维素、多糖生物合成的纤维素合成酶基因亲缘关系较近,推测克隆的基因可能参与纤维素合成或参与多糖的生物合成过程,该基因的具体功能有待进一步深入研究.     

生长素结合蛋白基因转化黄瓜的研究

 筛选出较适合于津研4号黄瓜子叶再生的培养基B2(MS+BA 2.0 mg·L-1)和生根培养基B8(MS)。将拟南芥生长素结合蛋白基因转入该黄瓜品种中,获得了经PCR鉴定、Southern和Northern杂交检测的转基因植株。转基因黄瓜的单性结实率平均为31.7%,高于对照(19.9%)。     

水稻硫转运蛋白基因OsST的亚细胞定位

[目的]构建水稻硫酸根转运基因OsST与YFP黄色荧光蛋白融合表达载体,对OsST蛋白进行亚细胞定位。[方法]从水稻叶片的cDNA中克隆OsST基因ORF全长,测序验证后连入pAT—YFP表达载体,通过基因枪将融合栽体转入洋葱上表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中荧光发光部位。[结果]OsST蛋白定位于细胞膜和核膜上。[结论]为进一步研究硫转运蛋白的功能及硫酸根运输的机理奠定了基础。     

生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达及纯化

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和 IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明：在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16 ℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25 ℃和0.4 mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,但BL21(DE3)菌种中的GST–AtTIR1表达量很低。利用GST SefiroseTM resin亲和树脂对表达的蛋白进行纯化,获得了较纯的AtTIR1和IAA28蛋白。     

MxIrt1基因瞬时表达载体的构建及其定位的初步研究

以绿色荧光蛋白为标记,构建瞬时表达载体pMxIRT1-GFP。以基因枪轰击洋葱表皮细胞,通过激光共聚焦显微镜(Confocal)观察,MxIrt1基因主要定位在细胞膜上。     

桃果实生长素结合蛋白ABP1的组织定位及蛋白表达分析

【目的】生长素几乎参与调控植物发育的各个方面。生长素信号转导存在由ABP1（auxin binding protein 1）介导的途径,ABP1作为一种生长素快速响应蛋白参与调控果实发育等生理过程,其主要存在于正在发育的胚及胚的周围组织中。本文旨在研究ABP1是否参与桃果实发育过程,探讨其分布与表达特点,为进一步研究桃果实发育机制奠定理论基础。【方法】以‘24号’桃果实为研究对象,测定其生长曲线以确定果实发育的3个典型时期。分离不同发育时期的中果皮、内果皮和种子,切块后,一部分样品放入EDAC溶液抽真空后进行戊二醛和多聚甲醛固定,固定后的样品经脱水和浸蜡处理后用于石蜡切片;另一部分样品液氮速冻后-80℃保存提取蛋白。制备效价较高的ABP1兔源多克隆抗体,应用免疫组织化学定位技术对自然发育状态下不同发育时期桃果实种子和中果皮中ABP1进行定位分析;应用Western blot技术分析桃果实中果皮、内果皮和种子中ABP1的表达情况。【结果】根据桃果实生长曲线,将发育时期分为3个时期,即第一次快速生长期、硬核期和第二次快速生长期。免疫组织化学定位结果表明,同一发育时期ABP1在种子的不同部位都有分布,且分布信号差异不明显。在种子发育的各时期,ABP1在种子的不同部位都有分布,主要分布在种子的内外种皮细胞以及种皮内维管组织周围的细胞中,且在观测的发育时期内,ABP1的信号强弱没有明显变化。在种子内、外种皮之间的细胞层中会出现零散的、呈带状分布的ABP1信号。而在中果皮发育的整个时期,ABP1只在硬核期维管组织周围的细胞中有明显分布。Western blot结果表明,中果皮中ABP1的表达在果实第一次快速生长期开始（盛花后41 d）及第二次快速生长期开始（盛花后76 d）时的表达量最高,在盛花后39 d的表达量最低。种子中ABP1的表达量要高于中果皮与内果皮。【结论】ABP1在果实内的分布与表达水平存在组织和发育时期的差异性,ABP1因子参与了生长素对桃果实发育的调控过程。     

苹果砧木山定子MbNas1的克隆、表达与亚细胞定位

以苹果砧木山定子(Malus baccata)为试材,根据小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)中克隆得到的尼克烟酰胺合成酶基因Mx Nas1(登录号:DQ403256)的全长序列设计特异引物,通过RT-PCR方法从山定子c DNA中克隆到Nas1基因并命名为Mb Nas1,该基因全长为978 bp。预测该基因可编码325个氨基酸,理论等电点为5.26,相对分子质量为36.09 ku。Real-time PCR结果表明,正常供铁(EDTA-Na Fe,40μmol/L)时,该基因在山定子水培苗的新叶、老叶、根、茎的韧皮部中均有表达,在木质部表达量较低;缺铁处理(4μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达加强,第6天达到最高值,之后开始下降;在老叶中表达逐渐减弱;高铁处理(160μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达减弱,在第9天达到最小值,之后有所上升;在老叶中表达逐渐增强。基因枪亚细胞定位试验表明,Mb Nas1蛋白质定位在细胞质膜上。     

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。     

人蛔虫和猪蛔虫线粒体nad5基因的序列分析

以采自中国不同地方的人蛔虫与猪蛔虫为研究对象,PCR扩增其线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅴ基因(nad5)的部分序列(pnad5)并进行序列测定,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对。结果显示:所获得的pnad5序列长度一致,均为556 bp;人蛔虫和猪蛔虫的pnad5序列差异仅为0.0%~2.6%,本研究结果支持人蛔虫与猪蛔虫是同一个种的结论。     

钙营养对温室毛桃果实品质及 生理生化特性的影响

以春元、春艳为试材,研究了在温室条件下喷钙对果实品质及生理生化特性的影响.结果表明:与对照相比,喷钙处理提高了果实中Ca2+的浓度,增加了果实中可溶性糖的含量,降低了可滴定酸的含量,增加了可溶性蛋白及Vc的含量,同时提高了POD的活性,降低了PPO的活性,进而改善了果实品质及贮藏性能.     

长喙田菁SrPCS1的原核表达及多抗血清的制备

以原核表达载体pGEX-4T-1为基础,通过PCR、酶切与连接构建了含长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS1 cDNA开放阅读框序列的GST-SrPCS1原核表达载体pAM34,并将其转化表达菌株BL21(DE3),在28℃,用0.1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白的表达,通过Western blotting鉴定融合蛋白,将SDS-PAGE分离得到的融合蛋白质免疫新西兰白兔,通过Western点杂交对免疫血清的效价进行检测。研究结果表明:通过大肠杆菌表达出GST-SrPCS1融合蛋白,免疫血清的效价为1∶2 000,制备的血清有较高的活性与特异性。