实时荧光定量PCR技术在检测外源基因拷贝数中的应用

通过对PCR法、Southern Blot法、IPCR法与实时荧光定量法4种转基因外源基因检测方法的比较认为:PCR扩增虽十分灵敏,但有时会出现假阳性扩增,因而对外源基因是否整合还需进行验证.Southren方法准确性高,特异性强,但存在费时、费力的缺点.同时实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA,而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后,一般都比较细弱,不宜大量取样.IPCR法虽可以转座突变分离基因,但当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时,由于T DNA整合到染色体中引起插入突变并分离基因造成误差.实时定量PCR技术的特异性和高信噪比为转基因拷贝数定量提供了方便,实时定量PCR法,花费试剂少、节省劳力和时间,需要DNA样品量少、并不进行放射检测.同时对实时荧光定量PCR法计算进行了详细介绍.     

实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR的原理、影响因素以及在植物病害和遗传育种方面的应用等进行了综述。     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

实时荧光定量PCR法测定禽蛋中沙门氏菌

为建立禽蛋中沙门氏菌的荧光PCR法检测方法,根据invA基因序列设计实时荧光定量PCR引物和探针,常规方法提取菌体DNA,以55℃为退火温度进行荧光PCR扩增,并进行方法学考察。结果表明:阳性对照品和沙门氏菌为模板的样品有明显扩增曲线,其他菌株为模板的样品无扩增曲线,特异性、灵敏度和重现性考察提示实时荧光定量PCR方法符合检测方法学要求。实时荧光定量PCR法的应用,提高了禽蛋制品中沙门氏菌检测的灵敏度、缩短了检测时间、简化了检测流程。     

鸡毒支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

 【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。     

含有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立含有扩增内标（IAC,Internal amplification control）的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。【方法】分别基于猪的beta actin 基因和鸡的transforming growth factor 基因设计引物和探针;考察引物和探针的特异性与灵敏度;设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR体系;使用该检测体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价;应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。【结果】含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5 ng DNA;该体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。     

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

奶牛GPR109A基因SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础。【方法】根据Gen Bank中奶牛GPR109A基因和β-actin基因(内参基因)的m RNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织c DNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验。【结果】GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2=0.9997),扩增效率分别为101.0%和100.0%。特异性试验结果显示,GPR109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7%。【结论】基于GPR109A基因建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析。     

一种牛肉检测的荧光实时定量方法研究

[目的]开发一种用于牛源性成分检测的荧光实时定量检测方法。[方法]通过序列比对后,以牛源性线粒体DNA中cytb基因为模板,设计特异性的引物和探针,并以不同来源的DNA为模板,分析引物和探针的特异性。对牛源性DNA进行梯度稀释后,分析不同浓度下扩增曲线,分析检测方法的灵敏度。以牛源性DNA稀释液为模板,进行10个平行扩增试验,分析检测方法的精密度。[结果]该研究所用的引物和探针对牛源性DNA具有明显的扩增曲线,而对非牛源性(鸡、鸭、猪、人)DNA模板不进行扩增。灵敏度分析结果显示,该检测方法对浓度仅为24.4 pg/μL牛源性DNA模板仍进行阳性扩增。精密度分析显示,10个平行试验扩增曲线相似,Ct值的标准差(SD)仅为0.41,精密度(CV)也仅为1.6%。[结论]该研究开发的牛肉成分检测的荧光实时定量方法特异性高,仅对牛源性DNA发生扩增。同时该方法灵敏度也很好,检出限为24.4 pg/μL,精密度也很高,重复性良好,适用于市场上肉制品中牛源性成分的检测。     

香蕉细菌性枯萎病菌荧光 LAMP 检测体系的建立

【目的】基于香蕉细菌性枯萎病病原(Ralstonia solanacearum)2号生理小种的特异保守引物和LAMP技术建立一种实时荧光定性检测方法,解决常规PCR定性检测特异性低、灵敏度低、耗时长等问题,实现在1 h内能进行准确高效的定性检测,为加强该病害防控检测和检疫工作提供技术支持。【方法】确定被测基因靶序列,利用Primer软件设计两对内外引物。由两对引物、具有链置换特性的DNA聚合酶、模板DNA、甜菜碱、Mg_2SO_4、反应缓冲液、荧光染料等组成LAMP反应体系,采用不必在反应完开管盖检测的实时荧光LAMP方法,针对该方法对于样品DNA定性检测的灵敏度、特异性及可重复性进行试验。【结果】设计的引物能顺利扩增目标基因,实时荧光LAMP检测体系对于香蕉细菌性枯萎病病原生理2号小种有良好的灵敏度、特异性,该方法可重复性强,灵敏度比普通PCR高10倍以上。【结论】香蕉细菌性枯萎病菌荧光LAMP检测体系检测特异性强、灵敏度高、耗时短、不易污染,效果较好。     

产志贺毒素大肠杆菌stx2基因荧光定量PCR检测方法的建立及应用(英文)

[目的]建立检测产志贺毒素性大肠杆菌(STEC)stx2基因荧光定量PCR方法。[方法]根据GenBank中已发表的STEC stx2基因序列,在保守区域设计PCR引物和探针,构建重组质粒作为阳性模板,优化反应条件,建立荧光定量PCR方法。[结果]利用优化的荧光定量PCR反应体系建立了标准曲线。表明起始模板浓度与Ct值之间线性关系好,相关系数R2均达0.995以上;此方法特异性好,对10种非STEC肠道病菌无特异性扩增;敏感性高,初始模板的检出下限达1.0×102拷贝数/μl;重复性好,批内、指间变异系数均分别小于1%和5%。[结论]该研究成功建立了检测STEC stx2基因的荧光定量PCR方法,为快速检测样品中STEC提供了技术手段。     

实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来,实时荧光定量PCR技术在植物检疫研究上不断深入,大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

水稻OsCKX2基因表达实时荧光定量PCR检测技术的建立

从水稻花序分生组织总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增OsCKX2基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段克隆到pMD19-TSimple载体中,PCR鉴定并测序分析,制备成荧光定量PCR梯度浓度质粒标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。标准曲线结果表明,建立的OsCKX2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达1.0×102~1.0×107拷贝;扩增效率高(E=95.9%);稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数(CV)仅为:0.14%~0.29%和0.16%~0.35%;循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),可对OsCKX2基因表达进行准确实时定量。一个基于TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术,定量分析控制水稻谷粒数关键基因之一OsCKX2转录水平的技术体系被成功建立。该技术体系重组质粒标准品的制备方法具有很强的实用性;对基因OsCKX2的表达实时定量准确、可靠、便捷。     

羊蹄GAPDH基因的克隆及序列分析

为利用实时荧光定量PCR技术研究中草药羊蹄有效化学成分合成相关基因表达情况,采用针对多糖、多酚植物样品的总RNA提取试剂提取高质量的羊蹄总RNA,随后运用反转录PCR方法克隆了羊蹄甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的部分c DNA序列,并以该序列为模板设计引物,采用实时荧光定量PCR验证其作为内源参照基因的可靠性。结果表明:获得的核酸序列长564 bp,编码188个氨基酸;推导的氨基酸序列与西伯利亚蓼、拟南芥、小麦GAPDH基因编码的氨基酸序列同源性分别为92%、90%和89%;扩增曲线和熔解曲线显示设计的引物可应用于实时荧光定量PCR扩增。羊蹄GAPDH基因的克隆为利用实时荧光定量PCR技术研究目的基因表达情况奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

生鲜猪肉中含扩增内标的沙门氏菌Real-time PCR检测方法的建立

建立含扩增内标的生鲜猪肉中沙门氏菌Real-time PCR检测方法,以提高检测的准确性。根据沙门氏菌ttrBCA基因设计引物和探针,利用犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因构建和目标基因相同引物的扩增内标,并对退火温度和引物、探针的浓度进行优化,建立含扩增内标的Real-time PCR检测方法,用该方法对人工污染生鲜猪肉样品进行检测。结果显示,该方法对19株非沙门氏菌检测结果均为阴性,对36株沙门氏菌检测结果均为阳性,特异性较好,热学裂解制备DNA模板法检测灵敏度达100 CFU/ml,试剂盒提取DNA制备模板法检测灵敏度达1μl2.66拷贝。在25μl反应体系中加入扩增内标103拷贝不影响目标基因的扩增,该方法能在12 h内对人工污染沙门氏菌的肉样做出检测。该方法不仅可快速检测生鲜猪肉中的沙门氏菌,同时避免了假阳性现象的产生。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立1种特异、灵敏、高效的检测IBRV gE基因的荧光定量PCR方法,并为鉴别IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株的感染提供技术手段.方法 根据IBRV gE基因保守序列,设计一对引物,建立荧光定量PCR反应体系和反应条件,利用10倍梯度稀释病毒DNA进行荧光定量PCR扩增,以检测本试验建立的荧光定量PCR的灵敏度.用IBRV、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞、牛血清等进行特异性检测.用模拟样品进行临床应用试验.结果 本试验建立的荧光定量PCR方法,其灵敏度约为70 DNA拷贝/μL,除了IBRV从其他病毒和样品未扩增出曲线,临床模拟样品检测结果为0.03TCID50.结论 本试验建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏性高、快速,低污染等优点,因此临床上可以用于IBRV的检测和病原学调查.     

基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP)(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP )DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU~(EHP))起始模板范围为2.0×10~1～2.0×10~9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%～0.72%和0.56%～0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。