利用巢式PCR检测花生青枯病菌

为建立花生青枯病菌的快速检测技术,本研究利用细菌16S-23SrDNA内源转录间隔区(ITS)通用引物L1/L2扩增花生青枯病菌基因组DNA并对其扩增序列进行克隆测序,通过与其同属近缘种做比较,设计1对特异性引物W1/W2,利用该对引物与细菌通用引物L1/L2建立了花生青枯病菌的巢式PCR检测方法。结果显示,引物W1/W2只能从花生青枯病菌中扩增出374bp的特异片段;巢式PCR检测灵敏度可达10fg·μL-1基因组DNA,较常规PCR提高1000倍;该技术可用于花生青枯感病期或者发病潜伏期时的病害检测。     

辣椒土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用

【目的】建立简便、快速、准确同时检测辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、白绢病菌（Sclerotium rolfsii）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的多重PCR检测体系,为辣椒多种土传病害同时早期诊断提供技术支撑。【方法】以3种辣椒土传病害病原菌辣椒疫霉、白绢病菌和青枯病菌为研究对象,参考相关文献筛选出3种病原菌的3对特异性引物PCA1F/PCA1R、SCR-F/SCR-R和RalfliC-F/RalfliC-R,以引物浓度、退火温度、循环次数及延伸时间为变异因子,探索最佳反应体系,建立三重PCR检测方法,并基于田间实际发病样品对方法进行验证。【结果】优化的三重PCR反应体系25.0 μL: 3对引物PCA1F/PCA1R、SCR-F/SCR-R和RalfliC-F/RalfliC-R浓度分别为0.24、0.24和0.28 μmol/L,DNA模板各10 ng,2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL,ddH₂O补足至25.0 μL。最佳扩增程序: 94℃预变性1 min; 94℃ 30 s,55.8℃ 30 s,72℃ 45 s,进行35个循环; 72℃延伸10 min。建立的三重PCR体系可分别扩增出352、540和724 bp的特异性目的片段,体系灵敏度达10-1 ng/μL。利用建立的反应体系,对来自江西省不同市（县）的54份辣椒和土壤样品进行检测,样品检出率为100%。【结论】建立的三重PCR检测体系可对辣椒田间发病植株和土壤中辣椒疫霉、白绢病菌和青枯病菌进行快速、准确检测,可应用于辣椒多种土传病害并发的早期预防和流行监测。     

苹果黑星病菌的分子检测

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL引物320A/320B(10μmol/L),0.5μL聚合酶(5U/μL),1μL模版DNA(30ng/μL),加ddH2O至总体积25μL;反应程序为:94℃3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。利用该对特异性引物对包括苹果黑星病菌在内的26个苹果病原菌菌株基因组DNA进行的PCR扩增表明,只有苹果黑星病菌能扩增到1条约320bp的特异性条带,其他菌株及阴性对照的扩增产物均未检测到特异性条带。对接种苹果黑星病菌的苹果组织的检测表明,该对引物能特异性地检测到苹果黑星病菌的存在,其对苹果黑星病菌基因组DNA检测的灵敏度为100fp/μL。【结论】利用设计的特异性引物320A/320B,参考正交试验优化的体系和程序,结合简单的SDS法提取苹果黑星病菌基因组DNA,在1个工作日内即可完成对该病原菌的分子检测。     

广西上思县桉树青枯病原菌致病性的研究

[目的]为林业生产防治青枯病提供理论指导。[方法]从广西上思县2种发病症状的桉树病株根上收集青枯病病原菌,按柯赫原则研究其致病性。[结果]2种症状的90%以上分离物的菌落形态完全相同,分离培养证实均是与自然界完全相同的青枯病菌。人工培养基上培养的慢性型青枯病菌部分菌株发生变异,致病性减弱甚至丧失,急性型青枯病菌的菌株致病性未减弱。接种试验表明,急性型症状病株上分离所得青枯病病原菌致病力强于慢性型症状的病原菌,桉树苗木死亡率高,发病时间早,发病程度也有一定差异。[结论]2种症状分离到的病原菌都为青枯病菌,均有明显致病性,急性型病原菌致病力强于慢性型,筛选出4个致病力较强的菌株。     

香蕉细菌性枯萎病菌实时荧光PCR检测方法的建立

根据香蕉细菌性枯萎病菌与其它细菌菌株16SrDNA序列差异，设计并合成一对引物和一条具有稳定点突变特异性探针，建立了对香蕉细菌性枯萎病菌的实时荧光PCR检测方法。除烟草青枯病菌和马铃薯青枯病菌外，还对其它属细菌菌株进行了荧光PCR检测。结果表明，只有香蕉细菌性枯萎病菌产生荧光，其它细菌都没有荧光产生。从而证明此方法特异性强，灵敏度高，适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用。     

实时荧光PCR检测瓜类蔓枯病菌的方法研究

[目的]建立瓜蔓枯病菌(Didy mella bryoniae)的实时荧光PCR方法,为瓜蔓枯病菌快速分子检测奠定基础.[方法]通过Genebank网上已公布序列,选取瓜蔓枯病菌beta-tubulin(tub2)基因作为目的基因,设计了特异性引物和Taq Man探针,并对该引物和探针的反应条件进行优化.[结果]采用研究所设计的引物和探针对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,该引物和探针可高度灵敏地检测到瓜蔓枯病菌.采用实时荧光PCR方法,25μL体系中只要有8.9 pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到356 fg/μL,比普通PCR灵敏度高10倍.[结论]采用研究所设计的引物和探针对田间采集的病株和未知样品的检测,验证了引物和Taq Man探针的特异性.     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

海南生姜青枯病菌对农用链霉素的敏感性测定

从海南白沙、文昌等市县生姜主要种植区采样,经分离、纯化,获得生姜青枯病菌(Ralstonia solanacearum)菌株27株,采用抑菌圈法对72%农用链霉素可湿性粉剂进行了敏感性测定。结果表明:不同地理来源的生姜青枯病菌对农用链霉素敏感性差异明显,同一来源地的不同菌株也有一定的差异。EC50值分布在3.22~71.07μg/m L,平均EC50为34.69μg/m L;其中,白沙荣邦RB-2菌株最敏感,EC50为3.22μg/m L;而白沙邦溪BX-3菌株敏感性最低,EC50为71.07μg/m L。敏感性分布频率呈连续性单峰曲线,EC50值表现连续,符合正态分布,其平均EC50值34.69μg/m L可作为海南生姜青枯病菌对农用链霉素的敏感性基线,用于海南生姜青枯病菌对农用链霉素的抗药性监测。     

松干基褐腐病菌的分子检测方法

松干基褐腐病菌是我国重要的植物检疫性病原菌,为建立该病原菌准确、灵敏、快速的检测方法,根据该病菌与同属内形态与寄主上最接近的4个种的ITS差异区域,设计出一对特异性引物IW1、IW2,经PCR扩增,只有松干基褐腐病菌可得到约165 bp的产物,而其余作为对照的菌株均无此产物,其检测灵敏度为100 pg基因组DNA。此外,特异性引物IW1和IW2还适合于Real-timePCR,其检测灵敏度更低,为0.1 pg基因组DNA（20μL反应体系）。应用此2种方法均能成功的从人工污染了的松干基褐腐病菌的木块中检测出病原菌。     

玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法的建立与应用

【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp(大病斑菌)与490、136 bp(小病斑菌)的特异性目的条带。25μL多重PCR扩增体系:2×Multiplex PCR Mix 12.5μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃(大病斑菌)和55.0℃(小斑病菌),35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。     

植物青枯菌LAMP检测方法的建立

【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一,严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术,是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列,并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物,F3（5′- CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1,设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1,确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象,5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照,验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释,以原液和10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测,比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合,以LAMP检测方法对混合物进行检测,并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定,或通过加入1 μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了特异性检测青枯菌的LAMP方法,优化后确立了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2 μmol·L^-1）,镁离子浓度为6 mmol·L^-1,反应温度为63℃。特异性检测结果显示,仅参试青枯菌反应管中的反应液呈现绿色,表明建立的检测体系具有高度特异性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀释液为模板进行的LAMP和普通PCR检测结果显示,LAMP的检测灵敏度为1.42 pg,比普通PCR高10倍。能够快速准确地从植物组织悬浮液、罹病番茄植物组织及田间罹病样品中检测到青枯菌。【结论】建立的青枯菌LAMP检测方法,高效特异,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果,适合基层和现场检测。     

草莓枯萎病菌的分离与鉴定

从湖北省武汉市郊区草莓种植户的大棚内采集萎蔫的植株,分离致病菌,采用PCR扩增、病原菌形态鉴定、致病性、分子检测等方法检测草莓枯萎病菌。结果表明,形态观察为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),接种草莓后出现典型的草莓枯萎病菌症状;采用真菌的通用引物对ITS1和ITS4进行PCR检测,分离得到的致病菌株均能扩增出分子量为567 bp的特异性条带。结合形态、致病性测定和分子检测,确定分离和鉴定的病原菌为草莓枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.f.sp.fragariae Winks et Williams)。     

基于环式等温扩增的烟草青枯病病原菌快速检测方法

针对烟草青枯病的防控,开发快速、高效的病原菌检测方法是必要的。环式等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下快速完成靶标基因扩增的新方法。将青枯病菌贵州分离株FQY4基因组序列(NCBI号:CP004013)与其他已发表菌株序列比对分析,确定编码鞭毛蛋白的fliC基因的保守区域可被选作检测靶标。根据LAMP原理以及靶标序列的特点,设计了一组由6条引物组成的环式等温扩增反应体系。结果表明:61℃条件下孵育45min,可完成对青枯病病原菌单菌落和带菌烟草叶片的检测,结果判定可以通过颜色变化被肉眼直接识别,也可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。通过这种新方法,可以实现对青枯病菌菌落的快速鉴别,还可以用于对田间疑似带病烟草植株的快速检测。     

广西百色烟草青枯病的危害调查与病原菌分离鉴定

2014-2015年对广西百色烟区的烟草青枯病发生危害情况进行了较为全面的调查,并对具有典型青枯病症状的烟株进行病原菌分离及致病性鉴定。结果显示,烟草青枯病在百色市的靖西县、德保县、乐业县和凌云县主要种烟区普遍发生,部分茎下部黑色坏死病株复合感染黑胫病和根黑腐病中的一种或两种病害;隆林县的病害样本没有分离和检测出青枯病菌,推测该县烟草根茎类病害主要为根黑腐病和黑胫病。从百色市各主要烟区采集到疑似烟草青枯病害样本170个,通过特异培养基分离和青枯菌演化型鉴定获得青枯病菌137株,柯赫法则验证共有92株菌株为烟草青枯病致病菌株。选取其中典型菌株D3-12进行病原菌分类学鉴定,通过菌株16S r DNA序列测定和同源性分析,结合菌株的形态学观察、生理生化指标测定,将D3-12菌株鉴定为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。     

利用PCR技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)

根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法.     

玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR 检测方法的建立与应用

【目的】由大斑突脐蠕孢（Exserohilum turcicum）和玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolaris maydis）引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌（登录号MAT1-1：GU997138和MAT1-2：GU997137）和小斑病菌（登录号MAT1-1：X68399和MAT1-2：X68398）交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp（大病斑菌）与490、136 bp（小病斑菌）的特异性目的条带。25 μL多重PCR扩增体系：2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃（大病斑菌）和55.0℃（小斑病菌）,35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。     

贵州油茶软腐病病原检测

贵州是我国主要油茶种植省份之一,油茶种植爆发病虫害导致产量与质量急剧下降,其中软腐病最为显著。本文以油茶软腐病中的粉芽孢杆菌为例,结合实时荧光PCR和巢式PCR技术,检测油茶软腐病病原菌。荧光PCR检测过程为:设计反应程序与标准曲线,确定引物浓度、Mg~(2+)浓度,将油茶软腐病病原菌DNA作模板,通过特异性引物对L1/L2实现PCR扩增;在克隆质粒和病原菌XJ8-3-3悬液两种模板中,对比实时荧光PCR和普通PCR的灵敏度;向健康植株叶片注射软腐病粉芽孢杆菌悬液,培养5 d后,采集患病油茶植株根部、球茎等部位检测软腐病病原菌含量。巢式PCR检测病原菌过程为:菌株活化放置PDA平板培养两天并采集病原菌丝;根据油茶软腐病的ITS序列和GenBank中,近似种的ITS序列差异设计B1与B2两种特异性引物,经过预变性、变性等步骤完成扩增,扩增产物用于凝胶检测。检测结果如下:(1)两种模板环境下,实时荧光PCR检测灵敏度优于普通PCR技术100倍,叶柄组织的根部软腐病病原菌含量最少;(2)引物B1与B2检测油茶软腐病病菌得到405 bp左右的条带扩增产物,测序结果显示发病菌株的碱基序列和粉芽孢杆菌序列吻合。结果显示,两种PCR技术均可检测油茶软腐病病原中的粉芽孢杆菌,为防治油茶软腐病提供科学依据。     

一株生姜青枯病拮抗菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

[目的]筛选对生姜青枯病菌有较强拮抗活性的细菌菌株,鉴定并优化拮抗菌株的发酵条件,为拮抗菌株的田间应用和活性产物开发提供必要的前期基础.[方法]从生姜青枯病发病较重的田块采集17份健康生姜根际根围土样,采用稀释平板分离和室内活性测定,筛选对生姜青枯病菌有较强拮抗活性的细菌菌株;对拮抗菌株进行形态学、生理生化特性和分子生物学鉴定,并通过改变碳源、氮源、发酵温度、初始pH和发酵时间的长短等外界条件对拮抗菌株进行发酵条件优化.[结果]筛选出1株对生姜青枯病菌有较强拮抗活性的细菌菌株YA-1.结合形态学、生理生化特性和16S rDNA鉴定,确定YA-1菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).结合发酵条件的改变和室内活性测定,确定YA-1菌株的最佳发酵条件为:发酵温度32℃、初始pH 7.5、发酵时间48h,最佳培养基配方为NaC1 1.0％、CaCO3 0.2％、酵母粉0.5％、NH4H2PO4 0.05％、(NH4)2HPO40.05％和蛋白胨1.0％.发酵条件优化后,处理48 h,抑菌圈平均直径由优化前的23.0 mm提高到29.0 mm.[结论]YA-1菌株对生姜青枯病菌具有较高的拮抗活性,具有开发成生物农药的潜力.     

玉米南方锈病和普通锈病分子检测技术研究

为建立快速鉴定玉米南方锈病菌和玉米普通锈病菌的分子检测方法,有助于玉米锈病的早期预警和有效防控,利用真菌ITS通用引物分别对采自海南、河南、吉林的玉米锈病菌样品进行了rDNA-ITS区克隆和测序分析(GenBank登录号为:HM452902,HQ154021~HQ154038),并根据其变异区段序列分别设计了病原菌检测特异性引物。结果表明:设计的检测引物具有较高的种特异性和检测灵敏度,在普通PCR体系中可检测到南方锈病菌和普通锈病菌的锈病菌DNA的最低浓度分别为100和1pg/μL。本研究建立的检测体系对2种玉米锈病菌的快速分子鉴定及病害早期预警都具有重要应用价值。     

甘肃省白菜死棵病病原菌鉴定及其融合群检测技术

【目的】明确引起甘肃省白菜死棵病的病原菌种类,并建立该病原菌的分子生物学检测方法,为白菜死棵病的预防及有效防治提供参考依据。【方法】对采自甘肃省的白菜死棵病菌分离、纯化培养,观察菌落形态,初步明确其病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）,为准确鉴定,从分离菌株中选取部分菌株利用通用引物rDNA-ITS和TEF-1α（translation elongation factor,1-alpha）进行PCR扩增、测序,采用MEGA 7.0中最大似然法（maximum likelihood,ML）构建系统发育树,同时用特异性引物对F-RS/R-RS进行融合群鉴定;采用叶面喷雾和茎基部灌根法对20个白菜品种进行致病力测定。根据立枯丝核菌rDNA-ITS基因保守区域序列,运用Primer 5.0设计1对特异性检测引物,建立实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,real-time PCR）检测该病原菌的方法。利用立枯丝核菌融合群（anastomosis groups,AGs）AG3—AG11、双核丝核菌AG-A（binulceate Rhizoctonia AG-A）、水稻纹枯病菌（R. solani AG-1-IA）、镰孢菌（Fusarium spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）等常见病原菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR检测,对特异性、灵敏度和可重复性进行评价。利用该体系对人工接种不同天数和田间采集的白菜病株及其根际土壤进行检测。【结果】共分离得到86株立枯丝核菌,经常规PCR特异性检测,结果表明大多数菌株属于立枯丝核菌融合群AG-2-1（68/86）,少数为AG-1-IB（18/86）;选取50个代表菌株进行ITS和TEF-1α基因测序和系统发育分析,AG-2-1和AG-1-IB分别与相应融合群参考序列聚在一支,且亲缘关系置信度为100％;致病力测定结果表明,两个融合群代表菌株对20个白菜品种的茎基部均可致病,AG-2-1对金娃娃、小皇宝叶部无致病力,且AG-1-IB的致病力稍强于AG-2-1。设计的引物特异性强,常规PCR检测结果表明仅白菜死棵病菌有扩增条带。Real-time PCR检测结果表明引物F-RS/R-RS特异性强,对白菜上立枯丝核菌有唯一的产物吸收峰,对其余对照菌株均未检测到荧光信号。常规PCR检测的灵敏度为8.41×10 ⁵copies/μL,real-time PCR的灵敏度可达到8.41×10 ³copies/μL,提高了2个数量级。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.9983,扩增效率为91％。该方法能成功检测出田间采集的白菜病株及根际土壤中的立枯丝核菌,对人工接种后不同发病天数的盆栽白菜进行real-time PCR检测,结果表明接种后第5天植株及土壤带菌量最大。 【结论】通过对白菜死棵病菌进行分子生物学鉴定和致病力测定,明确了甘肃省白菜死棵病是由立枯丝核菌 AG-2-1和AG-1-IB两个融合群侵染所致。建立的real-time PCR测定立枯丝核菌的方法特异性强、灵敏度高,可实现植株和土壤的带菌检测及监测,可为病害早期预警及管理提供技术支持。