木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

芋淀粉合成酶基因家族的鉴定、生物信息学及表达分析

【目的】鉴定芋淀粉合成酶(CeSS)基因家族,并对其生物信息学及表达模式进行分析,为芋产量、品质和营养性状的遗传改良提供参考。【方法】使用HMMER 3.12b软件以SS基因家族典型保守结构域Glyco＿transf＿5为模型,鉴定芋基因组中SS基因家族信息,利用生物信息学软件分析其分子结构特征、系统发育关系及顺式作用元件,采用转录组和实时荧光定量PCR技术检测其在正常生长发育条件和干旱胁迫下的转录表达。【结果】在芋基因组中鉴定了6个SS基因(CeSS1、CeSS2、CeSS3-1、CeSS3-2、CeSS4和CeGBSS1)。6个预测的芋SS基因长度为4980～61 347 bp,对应的CDS长度为1275～2895 bp,编码蛋白的氨基酸残基数量为424～964个,分子质量为48 067.43～109 391.75 Da,理论等电点为5.18～6.11。系统进化分析显示6个芋SS蛋白分布在5个亚家族。基因结构分析显示,6个CeSS基因外显子数量为7～15个。在6个CeSS蛋白中鉴定出10个保守motif,其中7个获得注释。在保守结构域上,CeSS1、CeSS2、CeSS4和CeGB...     

鹤望兰八氢番茄红素合成酶基因克隆及表达分析

[目的]揭示八氢番茄红素合成酶(PSY)基因在鹤望兰花色形成中的作用.[方法]依据植物PSY基因的氨基酸保守序列设计引物,从鹤望兰黄色花萼中克隆PSY片段,对该片段进行序列比对和系统进化分析,并应用RT-PCR技术分析PSY基因在不同器官和花朵发育过程中的表达特性.[结果]克隆获得248 bp的PSY段,编码82个氨基酸,经注册,在GenBank的登录号为JN887695.由该片段推导出的氨基酸序列与其他植物的PSY蛋白有很高的同源性,其中与大蒜的亲缘关系最近,达90%,初步证明为目标基因.此外,该基因在鹤望兰始花期和黄色萼片中表达量最高.[结论]PSY可能在转录水平上对鹤望兰黄色花的形成起调控作用.     

荸荠淀粉的生产及其利用

荸荠为果莱兼用食品,具有特殊的风味和一定药用价值。攀西地区有广泛的荸荠原料来源,由于荸荠的供应期和贮藏期较短,综合加工利用极少。荸荠淀粉的生产是其综合加工利用的主要途径之一,有关生产工艺研究,对开发农副产品资源,促进地方经济的发展有积极作用。     

荸荠多酚氧化酶基因的克隆及其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达分析

利用RACE技术首次从荸荠中克隆得到PPO基因全长cDNA序列,并分析其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达变化。克隆得到的荸荠PPO基因cDNA序列全长为2 006 bp,开放阅读框长度为1 734 bp,编码577个氨基酸,命名为CwPPO(登录号:MG702489)。预测分析表明,CwPPO编码蛋白质的分子量为64.86 ku,分子式为C_(2891)H_(4417)N_(795)O_(873)S_(18),理论等电点为6.50,属亲水性蛋白。CwPPO蛋白可能定位于线粒体基质空间,具有3个典型的保守结构域和2个铜离子结合域。此外,预测发现CwPPO有20个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点及6个酪氨酸磷酸化位点,其二级结构以不规则卷曲为主。系统发育分析显示,CwPPO蛋白与菠萝、油棕有较近的亲缘关系。荧光定量分析发现,CwPPO在鲜切荸荠中的初始表达水平较低,但在贮藏后期表达量快速提高。     

小麦淀粉合成酶研究进展

针对目前有关淀粉理化特性方面的研究相对落后的状况,对相关文献进行分析。首先分析小麦籽粒淀粉需要的几种关键酶:ADP-葡萄糖、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉脱分支酶,其次对国内外小麦淀粉合成酶研究方面的进展进行了综述。     

小麦谷氨酰胺合成酶基因克隆与其表达特性分析

为了研究小麦谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的功能,利用RACE及RT-PCR技术克隆了小麦GS1(GenBank登录号:HQ840647)和GS2(GenBank登录号:JF894116)基因的全长cDNA.小麦GS1的cDNA全长为1 494 bp,GS2的cDNA全长为1 631 bp,并利用生物信息软件对GS1和GS2的基因序列以及所表达的蛋白特性进行了分析.利用半定量PCR和Western-bolt技术分别分析了小麦苗期叶片发育过程中GS同工酶基因转录和表达特点,结果表明,GS1在叶片开始衰老时转录和表达水平较高,GS2从叶片伸长期到定长期转录和表达水平最高.     

汉中黑稻花青素合成酶基因克隆及生物信息学分析

花青素合成酶(Anthocyanidin Synthase,ANS)是植物花青苷生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。为研究汉中黑稻的ANS多样性及起源,采用克隆测序的方法对汉中7种品种黑稻的ANS基因序列进行分析。采用生物信息学方法,对该基因序列进行对比,并构建系统进化树和同源树,对其编码蛋白从基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、导肽、二级结构和三级结构等方面进行预测和分析。结果表明7种汉中黑稻存在黑稻1、黑稻2两种基因序列,开放阅读框均为1 128bp,编码375个氨基酸。进化树表明黑稻1和黑稻2与籼稻、粳稻、浦竹仔、小麦等禾本科植物较近的亲缘关系,同源性分析表明黑稻1和黑稻2与籼稻等植物的ANS具有高度的同源性。氨基酸序列比对发现黑稻1和黑稻2仅有326位氨基酸不同。黑稻1的ANS蛋白含有2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶的保守结构域。ANS蛋白三级结构预测,发现黑稻1和籼稻存在差异,推测ANS可能是花青苷合成中起重要作用的关键酶。这些结果表明ANS基因是一个古老的基因,可以作为种属鉴定的参考基因,可能是影响黑稻花青苷生物合成的主要基因之一。     

紫菜薹花青素合成酶基因BcANS的克隆、表达与序列分析

根据前期在芥蓝中克隆的BaANS基因序列设计PCR引物,从紫菜薹(Brassica campestris var.purpurea)子叶中克隆到基因组DNA和cDNA序列,基因定名为BcANS;序列已提交NCBI数据库,登录号为GQ120562;BcANS的基因组DNA全长为1 637 bp,具1个560 bp的内含子,编码区全长为1 077 bp,编码358个氨基酸.RT-PCR检测结果表明:BcA NS在光照条件下表达,在暗培养植株的子叶和胚轴中未见表达;缺磷植株的子叶和胚轴在暗培养和光照培养下BcANS基因均有表达,但光照条件下的表达量较大.序列比对结果表明:BcANS与同科的甘蓝、芥菜和拟南芥的同源性最高,而与禾本科植物的同源性最低,在进化树上相距最远.对紫菜薹花青素合成酶基因的克隆和表达分析,为进一步开展基因功能和花青素生物合成机制研究奠定了基础.     

菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1 197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1 567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L~(-1) NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。     

龙眼SPS基因克隆及其表达分析

[目的]克隆龙眼蔗糖磷酸合成酶基因(DlSPS)并分析其表达特性,为深入探究SPS基因家族成员在植物生长发育过程中的调控机制提供理论依据.[方法]以石硖龙眼为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆DlSPS基因,对其进行生物信息学分析,并用实时荧光定量PCR检测龙眼不同组织[根、茎、叶、幼果、果皮、花、熟果(果肉和果皮)]的相对表达量;测定分析果实发育过程中蔗糖含量、SPS活性及DlSPS基因表达的相关性.[结果]克隆获得的DlSPS基因(GenBank登录号为KP769779)cDNA全长3504 bp,编码1057个氨基酸残基,其编码蛋白分子量118.38 kD,理论等电点6.09,脂溶指数85.53,不稳定系数43.69,亲/疏水性平均值-0.412,为不稳定的亲水蛋白.DlSPS蛋白与温州蜜桔(BAA23213.1)SPS蛋白同源性最高,聚在同一小分支上,表明二者亲缘关系较近.DlSPS蛋白二级结构中,α-螺旋占35.0%,延伸链占13.8%,无规则卷曲占51.2%,与其三级结构预测结果相符.DlSPS基因在不同组织中均有表达,但表达量存在明显差异,其中在叶中的表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),其次是在幼果和花中的表达量,在根、果肉、果皮和茎中的表达量较低.龙眼果实发育过程中,蔗糖含量和SPS活性均呈先上升后下降的趋势,但蔗糖含量在谢花后101 d达最大值,而SPS活性在谢花后94 d活性达最大值,说明SPS活性与蔗糖积累具有一定的相关性.DlSPS基因的表达量随着果实发育呈略微下降—大幅上升—略微下降的变化趋势,在谢花后101 d表达量达到最大值,此时蔗糖含量也达最大值.[结论]SPS在龙眼不同组织生长发育过程中对蔗糖积累发挥重要作用,尤其是对叶片和果实中蔗糖积累发挥关键作用.     

荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达

【目的】克隆荸荠Eleocharis tuberosa苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在荸荠不同组织中和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况,为揭示鲜切荸荠黄化机理提供理论依据。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从荸荠中克隆PAL基因的cDNA全长,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用荧光定量PCR技术分析PAL基因在荸荠不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况。【结果】克隆得到荸荠PAL基因全长cDNA,将其命名为CwPAL,该序列长度为2 485 bp,含有1个2 142 bp的完整开放阅读框,共编码713个氨基酸。CwPAL蛋白分子式为C3437H5514N944O1058S34,相对分子质量为78 079,等电点为5.97,原子总数为10 987个。CwPAL包含PAL-HAL和PLN02457结构域及典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIAG)。CwPAL的二级结构以α–螺旋为主,其三维结构模型呈典型的"海马状"结构。系统进化分析表明,CwPAL与菠萝Ananas comosus和海枣Phoenix dactylifera的PAL蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwPAL基因在荸荠皮中的表达量最高,鲜切荸荠贮藏过程中CwPAL基因表达量快速上升,水杨酸处理显著抑制了CwPAL基因的表达。【结论】Cw PAL属于典型的苯丙氨酸解氨酶家族,该基因可能通过调控苯丙烷代谢从而影响鲜切荸荠的黄化。     

小麦籽粒淀粉合成酶基因表达、相应酶活性及淀粉积累三者的关系

为研究小麦籽粒淀粉形成的机制,以秦麦11为试验材料,对小麦籽粒灌浆期淀粉合成酶基因表达、相应酶活性及淀粉积累变化进行了研究。结果表明,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(AGPase)、束缚态淀粉合成酶基因(GBSSI)、可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、淀粉分支酶基因(SBE)表达均呈单峰曲线变化,AGPase和SSS基因于花后12 d左右相对表达量最大,GBSSI和SBE基因于花后15 d左右相对表达量最大。4种淀粉合成酶活性变化趋势一致,花后25 d或30 d之前呈上升趋势,之后急剧下降。淀粉及其组分积累量随着灌浆的进行呈不断上升趋势。直、支链淀粉及总淀粉积累速率峰值在花后25 d或30 d。相关分析表明,AGPase、SSS、SBE基因在花后15 d相对表达量与相应酶活性间呈极显著正相关,而GBSS基因的相对表达量与GBSS活性间未检测到相关。暗示AGPase、SSS、SBE基因在籽粒淀粉合成过程中可能属于转录水平调控,而GBSSI基因可能属于转录后调控。4种淀粉合成酶活性与直、支链淀粉及总淀粉积累速率均呈极显著正相关,说明这几种酶对淀粉合成共同起作用。     

甘薯S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与表达

从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明:该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。     

红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成。采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS（GenBank登录号：DQ364604）。该基因编码区长为1182bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位。对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子。该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点。     

荸荠淀粉的制作

将新鲜荸荠人工清洗，并用木棒在浸泡池内搅拌搓擦，—般换水2～3次即可清洗干净，最后再用清水淋洗1次。然后进行破碎，破碎可采用捣碎，或盘式、锤片式粉碎机，亦可采用盘式磨粉机，破碎以皮渣内层无白色肉质为宜。     

纤维亚麻LuNAC10基因克隆及表达分析

NAC作为植物特有转录因子,调控植物细胞次生壁合成。研究从高纤亚麻“Diana”中克隆得到Lu NAC10(Lus10013967)基因。通过序列分析发现,基因Lu NAC10开放阅读框总长度为978 bp,共编码325个氨基酸,蛋白分子质量为35.53 ku,其中蛋白疏水系数-0.787,为亲水性蛋白,不稳定系数38.10,属不稳定蛋白,无跨膜结构,具有单个典型NAM结构域,通过PSORT分析推测Lu NAC10蛋白定位于细胞核中。通过同源比对和聚类分析发现,亚麻Lu NAC10与拟南芥SND3蛋白（AT1G28470）进化关系最近。q RT-PCR结果表明,Lu NAC10基因表达量高峰出现在亚麻茎下部1/3处,亚麻根部及茎中部次之,叶片中表达量最低;从苗期到工艺成熟期,该基因表达量总体呈先升后降趋势,并在亚麻快速生长期表达量达到最高。该基因与参与次生壁合成的纤维素合酶基因Lu Ces A4、Lu Ces A8A表达量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数分别为0.989和0.987。同时,Lu NAC10基因表达量与纤维素含量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数...