荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达

【目的】克隆荸荠Eleocharis tuberosa苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在荸荠不同组织中和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况,为揭示鲜切荸荠黄化机理提供理论依据。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从荸荠中克隆PAL基因的cDNA全长,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用荧光定量PCR技术分析PAL基因在荸荠不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况。【结果】克隆得到荸荠PAL基因全长cDNA,将其命名为CwPAL,该序列长度为2 485 bp,含有1个2 142 bp的完整开放阅读框,共编码713个氨基酸。CwPAL蛋白分子式为C3437H5514N944O1058S34,相对分子质量为78 079,等电点为5.97,原子总数为10 987个。CwPAL包含PAL-HAL和PLN02457结构域及典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIAG)。CwPAL的二级结构以α–螺旋为主,其三维结构模型呈典型的"海马状"结构。系统进化分析表明,CwPAL与菠萝Ananas comosus和海枣Phoenix dactylifera的PAL蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwPAL基因在荸荠皮中的表达量最高,鲜切荸荠贮藏过程中CwPAL基因表达量快速上升,水杨酸处理显著抑制了CwPAL基因的表达。【结论】Cw PAL属于典型的苯丙氨酸解氨酶家族,该基因可能通过调控苯丙烷代谢从而影响鲜切荸荠的黄化。     

唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析

克隆唐菖蒲AOC基因的全长cDNA序列,并分析该基因的表达模式及其对茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成的影响。以唐菖蒲栽培品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆AOC基因的全长cDNA序列;利用基因枪方法进行GhAOC基因的亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR技术分析GhAOC基因的表达模式。克隆了1个全长为898bp的茉莉酸生物合成关键酶丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase,AOC)基因的cDNA序列,命名为GhAOC。该序列含有1个735bp的开放阅读框(ORF),编码244个氨基酸,推导的蛋白质分子量为26.52ku。亚细胞定位分析表明GhAOC是叶绿体蛋白。实时荧光定量RT-PCR表达分析显示,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,其中在新球茎和籽球中表达量最高;经过0.1～0.5mmol/L的MJ(methyl jasmonate,茉莉酸甲酯)处理后,逐渐提高了GhAOC基因在球茎中的表达量和内源MJ含量。GhAOC基因的表达促进了唐菖蒲茉莉酸的生物合成。     

烟草转录因子NtMYB42基因的克隆与分析

[目的]克隆烟草木质素生物合成途径调控基因NtMYB42,为烟草品质改良提供参考依据.[方法]利用同源克隆法从栽培烟草K326克隆出NtMYB42基因全长序列和cDNA序列,研究分析NtMYB42基因的结构、编码蛋白理化性质、亚细胞定位和同源性等.[结果]NtMYB42基因组和cDNA全长分别为2 312 bp和1 1...     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

芥蓝BoaBKI1基因的克隆及表达分析

[目的]克隆芥蓝中的BoaBKI1基因,进行生物信息学与表达分析.[方法]采用改良CTAB法提取芥蓝总RNA,并反转录为cDNA;设计引物,克隆BoaBKI1基因;使用生物信息学方法分析BoaBKI1基因序列;用半定量PCR进行BoaBKI1基因的时空表达分析.[结果]成功克隆到BoaBKI1基因,序列分析显示其开放阅...     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1 088 bp,其中ORF 771 bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80 kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

石栗accD因全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆石栗幼嫩叶片accD基因的全长cDNA序列,为今后利用该基因和提高油料作物种子含油量提供参考.[方法]根据已知植物麻疯树、蓖麻等accD基因的保守区域设计简并引物,以石栗幼嫩叶片为材料,利用简并PCR和RACE技术克隆accD基因的全长cDNA序列,扩增其编码序列.[结果]扩增获得的石栗accD基因全长cDNA序列长1789 bp,包含1509 bp的开放阅读框,可编码503个氨基酸,GenBank登录号为KC255250,并命名为amaccD.石栗accD基因序列经BLASTx比对后,发现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树氨基酸序列的同源性分别为90％、90％和89％.[结论]克隆获得的石栗accD基因全长cDNA序列与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树等具有较高同源性.     

青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鱼将DNA聚合酶β(OlPolβ)基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1 716 bp,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

塞内加尔鳎Survivin基因的电子克隆与生物信息学分析

[目的]克隆分析塞内加尔鳎的Survivin基因。[方法]利用生物信息学手段克隆塞内加尔鳎Sunvivin基因的全长cDNA序列,并对其序列进行分析。[结果]结果表明,该cDNA序列包含444bp的开放阅读框,编码147个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,塞内加尔鳎Survivin氨基酸序列与半滑舌鳎、斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人Surivin氨基酸序列具有较高的同源性。[结论]该研究结果为进一步研究塞内加尔鳎的Survivin基因提供基础。     

香蕉类受体蛋白激酶基因的克隆及杂交鉴定(英文)

[目的]克隆鉴定香蕉类受体蛋白激酶基因。[方法]以香蕉果实cDNA噬菌体文库为材料,筛选出香蕉类受体蛋白激酶基因阳性噬菌体库,对该基因进行克隆和序列分析,并通过原位杂交方法对其进行鉴定。[结果]试验克隆到1个长度为1698bp的香蕉果实类受体蛋白激酶基因,编码563个氨基酸序列。经过Southern杂交证实该基因来自香蕉基因组,是1个多拷贝基因。[结论]该研究结果为进一步研究香蕉类受体蛋白激酶基因在香蕉果实中的功能奠定了基础。     

青鳉DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鳉DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鳉DNA聚合酶β（OlPolβ）基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1716by,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

番茄γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]为进一步研究γ-生育酚甲基转移酶(TMT)基因的功能奠定基础。[方法]以拟南芥γ-TMT cDNA为信息探针,在GenBankdbEST数据库中搜索与其高度同源的番茄EST序列,通过人工序列拼接得到番茄γ-TMT的cDNA序列。据此拼接序列设计1对特异引物,以番茄叶片cDNA第1链产物为模板进行RT-PCR,回收目的片段,转化到大肠杆菌DH5α进行TA克隆。最后对获得的阳性克隆进行测序,分析测序结果与其他物种中该基因之间的同源性,进行氨基酸序列比对及系统进化分析。[结果]经RT-PCR扩增出1300bp左右的片段,成功克隆了番茄γ-TMT基因。克隆片段全长1354bp,包含1个1089bp的完整开放读码框,与拼接序列完全一致。番茄γ-TMT基因编码的氨基酸序列与马铃薯、小麦、玉米和拟南芥的γ-TMT基因的同源性分别达89%、75%、75%和70%。系统进化分析表明,番茄与马铃薯的γ-TMT基因有较近的亲缘关系。[结论]该试验中克隆的番茄γ-TMT基因编码的蛋白质分子量为39.8kD,等电点为8.28。     

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1088bp,其中ORF771bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

云南切梢小蠹热激蛋白20基因克隆及序列分析

[目的]对云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)成虫热激蛋白20基因(TynHSP20)进行克隆和序列分析,为研究该虫在高温环境下的抗逆机制打下基础.[方法]采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆云南切梢小蠹成虫TynHSP20基因cDNA序列,并对其序列进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的TynHSP20基因cDNA序列长671 bp,含开放阅读框597 bp,5'端非编码序列和部分3'端非编码序列分别为44和33 bp.该基因编码198个氨基酸,预测蛋白质分子量为22.50 kD,等电点为7.86,包含一个保守的α-晶体蛋白结构域.同源性比对分析结果表明,TynHSP20蛋白氨基酸序列与东亚飞蝗、蓼蓝齿胫叶甲、斜纹夜蛾和美洲斑潜蝇的HSP20氨基酸序列相似性均低于20%.系统发育分析结果显示,TynHSP20与沙葱萤叶甲的亲缘关系较近.[结论]成功克隆获得TynHSP20基因cDNA序列,该基因具有小热激蛋白家族的特征,但与其他物种小热激蛋白的同源性较低.     

唐菖蒲GhAOS基因的克隆与表达

丙二烯氧合酶(AOS)是茉莉酸(JA)生物合成途径中的关键酶,为深入研究AOS基因在唐菖蒲茉莉酸生物合成途径中的作用及唐菖蒲球茎膨大的分子机制,以唐菖蒲品种‘Rose Supreme'的球茎为试材,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个GhAOS的cDNA序列,序列内部含有一个1 533 bp的开放阅读框(ORF...     

绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并用检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

用于DNA转染的PRRSV全长感染性cDNA克隆改建及应用

[目的]利用核酶自我剪切功能使PRRSV的基因组获得1个精确的基因组3′末端,提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率。[方法]用3步PCR方法将获得含有丁型肝炎病毒核酶序列的片段并将其克隆到PRRSV全长cDNA克隆pAPRRS的poly（A）下游,再通过酶切,连接将牛生长激素多聚腺甘酸转录终止序列插入到核酶序列后,构建成全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB,新构建的克隆转染MARC-145细胞,72h后用间接免疫荧光检测病毒N蛋白和非结构蛋白2（nsp2）的表达,并检测细胞上清中病毒的滴度。[结果]成功构建了含有核酶序列的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆pAPRRS-HB。新构建的全长感染性cDNA克隆能够较好地拯救出病毒,拯救效率比pAPRRS提高10倍左右。[结论]该结果为研究PRRSV基因结构与功能奠定了基础。     

赛买提杏自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

[目的]克隆新疆主栽杏(Prunus armeniaca)赛买提自交不亲和性花粉SFB基因全长序列,为今后通过分子改良培育具有自交亲和性的赛买提杏奠定基础.[方法]通过RT-PCR法克隆获得赛买提杏花粉SFB基因中间片段,RACE技术克隆cDNA全长,DNAMAN预测其氨基酸序列,并将编码蛋白与自交亲和的杏SFBC基因进行比对.[结果]克隆到1个全长为1 373 bp的SFB基因,命名为SFB60(GenBank登录中).该基因包含1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸.与SFBC基因相比,该蛋白有2个变异区(V1和V2)和2个高变区(HVa和HVb),N端有一段由42个氨基酸组成的F-box结构域,而SFBC基因缺少2个高变区.[结论]获得了赛买提杏花粉自交不亲和SFB60基因cDNA全长序列,为进一步以分子育种的方法来改良赛买提杏的研究奠定了基础.