牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定

【目的】 诊断致犊牛腹泻冠状病毒。【方法】采集石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场141份腹泻犊牛粪样,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行冠状病毒检测,PCR方法进行核酸复检。同时根据GenBank登录的牛冠状病毒 N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到PMD 19-T载体后,将测序正确的基因片段经EcoRI和HindIII双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,进行测序,亚克隆入BL21(DE₃)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。【结果】所采集141份腹泻犊牛粪便中,用ELISA检测阳性率70.21%;再用RT-PCR检测出阳性率为61.7%同时,克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1 400 bp,双酶切鉴定目的条带正确,测序结果与标准序列的进行比对同源性达到98.22%,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE₃相对分子质量为54KD;重组蛋白BCV-32a-N-DE₃相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE₃和BCV-28a-N-DE₃和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应。【结论】犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原;ELISA方法和RT-PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义。获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好的免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础。     

牛轮状病毒免疫初探

研究证实,轮状病毒是近年来广泛流行于黄淮平原地区的黄犊牛腹泻症的主要致病因子之一.作者先后从安徽、河南两地的腹泻黄犊牛粪样中分离出3株适应MA-104细胞的轮状病毒株,通过人工发病试验证实它们对剥夺初乳的黄犊牛有致病作用.我们用牛轮状病毒BRV014高代细胞培养物,通过非肠道途径,在黄犊牛腹泻流行区免疫孕期母牛,较有效的控制了黄犊牛腹泻症的发生.材料与方法(一)病毒及免疫物牛轮状病毒BRV014株系从安徽省界首县黄犊牛腹泻粪样中分离.病毒经胰酶预处理后,接种MA-104细胞单层.待产生75%以     

牛轮状病毒的分离及其RT-PCR鉴定

采用MAl04细胞从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪样中进行轮状病毒分离，盲传4代后接种细胞出现明显细胞病变（CPE），对分离病毒进行核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条带为4：2：3：2型，具备典型A群轮状病毒特征。依据NCBI等登录的牛轮状病毒的VPl基因序列设计一对引物，对其VPl基因进行克隆及序列分析，结果分离毒与国外牛轮状病毒分离株RF的核苷酸同源性为98．9％，与UK的核苷酸同源性为91．5％，证明分离毒株是一株牛轮状病毒。     

河南省部分地区黄犊牛腹泻症病原和治疗的研究报告

从一九八六年至一九八七年对我省黄犊牛腹泻病的流行病学、病原、临床诊断和治疗进行了比较系统的研究。调查1799头黄犊牛,发病1079头,发病率60.98％;死亡106头,死亡率5.89％;致死率9.66％。应用电镜观察51份腹泻犊牛粪样,30份有轮状病毒颗粒,检出率58.82％。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PACE)直接检验病毒核酸60份粪样,33份出现典型的轮状病毒核酸电泳图谱,检出率55％。二而符合率96％(48/50)。采用白痢散和犊痢汤配合补液纠酸等方法进行治疗试验,疗效显著。     

牛呼吸道疾病综合征相关病毒BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV多重PCR检测方法的建立

根据Genbank发表的牛呼吸道综合征相关病毒中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)N基因、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′-UTR和牛副流感3型病毒(BPIV3)N基因设计特异性引物,建立了在同一体系内同时对4种病毒进行检测的多重PCR方法。该方法可以同时检测出DNA病毒IBRV的长306bp和反转录病毒BPIV3长422bp、BRSV长600bp及BVDV长130bp的特异性片段。本项研究中以已知IBRV、BPIV3、BRSV和BVDV作为参考毒株,对来自内蒙古、辽宁、安徽和吉林4个省、自治区的33例临床样品进行检测。结果表明,合并感染2种病毒较为多见,分别为BVDV和BRSV共感染,BPIV3和BRSV共感染,BPIV3和IBRV共感染,未检测到4种病毒同时感染临床样品。     

TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达

运用DNA重组技术将猪传染性胃肠炎病毒核衣壳基因、猪流行性腹泻病毒核衣壳基因编码最大局部亲水性抗原决定簇基因片段进行串联,克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建预防仔猪冠状病毒性腹泻双价基因原核表达质粒.将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,双价重组基因表达...     

牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒与牛冠状病毒三重RT-PCR方法的建立与应用

为建立快速同步检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒与牛冠状病毒的多重RT-PCR检测方法并应用于临床检测。根据GenBank中三种病毒参考毒株的基因序列,设计3对特异性引物。利用构建的三种病毒的标准质粒进行三种病毒的三重RT-PCR方法,进行特异性、敏感性和重复性检验,并进行临床样品检测。特异性结果显示,建立的牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的三重RT-PCR方法可特异性扩增出阳性标准质粒的基因片段,对牛源沙门氏菌、大肠杆菌、牛巴氏杆菌、牛支原体无扩增;敏感性结果显示,对牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒质粒核酸最低检测浓度分别为250、 250和25ng/mL。重复性结果显示,能扩增出一致的目的基因条带。临床样品结果显示,三重RT-PCR方法和单一RT-PCR符合率100%。可见,建立牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的三重RT-PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可进行临床检测。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR诊断方法的建立

利用分子生物学方法,选择禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及传染性支气管炎病毒的N基因,分别在基因序列的保守区域设计1对特异性引物,利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增,在优化单项RT-PCR条件的基础上,建立禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR的检测方法,同时对该检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这3对引物分别能特异性地扩增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及传染性支气管炎病毒的N基因片段,大小分别为385 bp、520 bp和748 bp,初步建立了快速、敏感、特异鉴别检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒的分子诊断方法。     

宁夏部分地区犊牛7种腹泻相关病毒的检测及分析

【目的】调查分析宁夏地区规模化奶牛场牛腹泻相关轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛环曲病毒(BToV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)、牛库布病毒(BKV)的感染情况。【方法】用RT-PCR方法对采集自宁夏部分地区的6个规模化奶牛场共计81份犊奶牛腹泻粪便样本进行检测,同时扩增相关基因进行分析。【结果】81份样本中BRV阳性率为16.05%,BCoV阳性率为13.58%,BToV阳性率为2.47%,BKV阳性率为2.47%,BVDV、BAstV、BNoV均无检出。BRV和BCoV的混合感染率为3.70%,BKoV和BToV的混合感染率为1.23%。遗传进化分析表明宁夏地区流行的BRV有G6型毒株,并且BCoV毒株具有不同的遗传进化趋势。【结论】BRV、BCoV仍是宁夏规模化奶牛场内最主要的犊牛腹泻病毒,同时检测到BToV和BKV,丰富了宁夏地区牛腹泻病原谱,为宁夏地区奶牛腹泻的综合防治提供了依据。     

5株野鸭源H6N1亚型禽流感病毒NA基因的克隆和进化分析

根据GenBank已知的H6N1亚型流感病毒的NA基因序列,设计扩增NA基因的特异性引物,通过RTPCR技术扩增5株H6N1亚型禽流感病毒NA基因序列,并将其克隆到pMD18-T载体后进行了测序分析.同时通过生物学软件对5株禽流感病毒NA基因进行了分析研究.结果表明:5株禽流感病毒NA基因全长1 410 bp,编码47...     

犬冠状病毒V1株核蛋白基因的克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒V1野毒株核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N基因序列,设计了1对特异性引物,对分离的CCV V1野毒株进行了RT—PCR扩增;将扩增得到的阳性PCR片段经纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN1,进行核苷酸序列测定,并与GenBank中CCV标准毒株Insavrc—1 N基因进行了比较。结果该基因全长为1146bp,编码382个氨基酸,两者核苷酸的同源性为91．7％;推导的氨基酸序列的同源性为90．2％,显示出较高的保守性。在V1野毒株推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒相应区域相同,推测可能是RNA结合区。另外,推导的该蛋白氨基酸序列其疏水性和抗原表位与标准毒株Insavc-1 N蛋白存在一定的差异;在氨基酸组成上,该蛋白丝氨酸和赖氨酸含量高达9．84％,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构：     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株动物回归试验

【目的】自流产奶牛粪便及血液中分离得到的非细胞病变型牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV),为了解分离毒株的特性,进行回归动物试验;【方法】将此分离毒回归2月龄健康犊牛,接毒25天后扑杀剖检,观察临床症状及病理变化。自犊牛体内采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞进行培养,分离病毒,进行细胞传代,将此细胞毒进行RT-PCR检测;【结果】犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。自病料分离病毒经MDBK细胞盲传至第9代,均未出现细胞病变。将此细胞毒进行RT-PCR检测,扩增出相应的665bp的片段;【结论】将分离株接种易感犊牛以复制出BVD-MD病症,并从试验牛体内分离得到BVDV,从而进一步确证分离到的毒株属BVDV。     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒NS基因的分子克隆及序列分析

根据GeneBank上已发表的H3N8亚型禽流感的非结构蛋白基因(NS)序列,设计了一对特异性引物,成功地从A/mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)中克隆到NS基因序列,该克隆基因全长860 bp,编码NS1和NS2两种非结构蛋白.与其他H3N8亚型的NS基因进行了同源性比较,核苷酸同源性为65.5%～98.3%,推导的氨基酸序列同源性为65.4%～97.8%.NS基因遗传进化树形成两个分支,该分离株处于等位基因B组.另外,此毒株NS基因在263～277位没有发生15个碱基的缺失.A/mallard/SanJiang/167/2006(H3N8)株149位为丙氨酸,其不能感染哺乳动物.     

狐貉源犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆及序列比较分析

参照已发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白基因(N)序列设计合成了1对引物,用RT-PCR方法对从发病狐、貉中分离的MS01、SC01、ZD01三株CDV的N基因进行扩增,并分别将其PCR产物进行克隆和测序。测序结果表明:3病毒分离株N基因阅读框架全长均为1572bp,编码523个氨基酸。利用DNAstar的MegAlign生物软件,将3病毒分离株与Genbank数据库中现有的CDV毒株的N基因序列及推导出的氨基酸序列进行了同源性比较和系统进化树分析,结果发现:3病毒分离株与强毒参考株A75/17等野毒株高度同源,核苷酸同源为96.2%～99.1%,氨基酸同源为96.0%～99.8%,而与疫苗株Onderstepoor相对较远,核苷酸同源为93.6%～94.0%。N基因的系统进化关系分析显示:3病毒分离株均归为强毒株,并且与中国新疆的TN株、中国台湾的Kaohsiung株基因型最近,表现出一定的地理位置相关性。     

Ⅰ型马立克氏病强弱毒株Meq基因的克隆与序列分析

[目的]为获得MDV-1强弱毒株Meq基因序列的差异。[方法]根据GENE BANK登录的马立克氏病毒Meq基因序列,设计一对引物,采用PcR技术对MDV—Ⅰ型国内商用CVI988／Rispens疫苗株和参考强毒京-1（BJ-1）株的Meq基因进行了扩增,并将扩增产物提纯后克隆到pcDNA3．1（＋）上,进行酶切鉴定及测序验证。[结果]CVI988疫苗株和BJ-1强毒株的Meq基因开放阅读框（ORF）长度分别为1200和1197bp。通过与国际标准强毒GA株Meq基因进行比较,BJ-1株和CVI988株Meq基因中分别有一段180和177bp的插入序列,第211住核苷酸由G变为T,导致第71位氨基酸由丙氨酸A变为丝氨酸S;同时,CVI988株Meq基因第228位核苷酸由A变为G,导致第77位氨基酸由赖氨酸K变为谷氨酸E。此外,与BJ-1株相比,CVI988株Meq基因在576～578bp之间缺失3个碱基（ACC）,并导致第193位脯氨酸P的缺失,该突变发生在一个多脯氨酸重复区域内。[结论]MDV-1强弱毒株Meq基因序列存在明显差异,为从其分子水平进行区分及生物学功能的研究奠定了基础。     

犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组序列分析

[目的]了解广西猪源H9N2亚型流感病毒的来源及变异情况,为有效防控广西猪源H9N2亚型流感病毒奠定基础.[方法]运用RT-PCR对广西分离株A/SW/GX/S11/05( H9N2)进行全基因组扩增,并克隆测序及对比分析.[结果]扩增获得的HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因片段长度分别为1683、1401、1497、1027、890、2233、2280和2151 bp,其推导氨基酸分别为561、467、499、349、338、744、760和717 aa.经过序列分析,发现各基因片段的核苷酸及其推导氨基酸与A/Bird/GX/62/05株的同源性最高,分别为96.2%~ 100.0%和98.5%~99.6%;系统进化分析也表明A/SW/GX/S11/05株与A/Bird/GX/62/05株的亲缘关系最近.[结论]广西猪源H9N2亚型流感病毒属于欧亚谱系的北京亚系,且在一定时间内不同宿主间均有感染,在今后的流感病毒防治工作中,跨种属传播是一个不可忽视的问题.     

用套式PCR法检测犬冠状病毒的研究

根据GenBank中Wesseling 发表的犬冠状病毒K378株纤突蛋白基因序列,设计合成了能扩增372 bp 基因片段的套式引物.用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽取法提取细胞总RNA进行反转录,再以此产物进行套式PCR扩增,并筛选出最佳套式PCR扩增条件.结果经套式PCR扩增能得到与设计大小相同的产物,并且不扩增犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬Ⅰ型腺病毒、狂犬病病毒的核酸.敏感性试验表明,此法能扩增出犬冠状病毒强毒细胞培养物(毒价为10-4.2TCID50/0.1 ml)10-6稀释的反转录产物,远高于常规RTPCR.经初步应用表明,此法可用于犬冠状病毒的临床诊断和实验研究.     

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。