猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D_{600 nm}值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×10⁴ CFU/μg DNA。     

猪A组轮状病毒pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的构建及表达

以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析.结果表明,在MRS培养基中加入1％甘氨酸+0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3～4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA. pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

乳酸乳球菌高效电转化方法的建立

以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactisNZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明：在固定电阻200Q、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2mm规格的电击杯,加入浓度为1．2μg／μL的质粒,在电场强度和脉）中时间分别为10kV／cm和5ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2h后涂板计数,转化效率最高可以达到2．6×10^4CFU／μgDNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。     

乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。     

不同剂量猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗肌肉注射诱导仔猪细胞免疫的研究

将猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白S1基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG-2中,构建了重组表达载体pPG-sl,将其电转化干酪乳杆菌Lcasei393,获得了表达PEDVsl蛋白的重组乳酸菌杆菌。重组杆菌诱导后,经westernblot、间接ELISA实验表明,目的蛋白获得了分泌表达。     

重组犬瘟热病毒F-H融合基因乳酸菌的构建及表达

为了构建重组犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增CDV F-H融合基因。将F-H融合基因亚克隆至穿梭载体p SIP409多克隆位点上,构建p SIP-F-H表达重组子,并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting检测F-H融合蛋白的表达情况。结果表明,成功地扩增了CDV F-H融合基因,构建了p SIP-F-H重组表达质粒,并电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测表明,重组乳酸杆菌表达了分子量约为62.96 ku的F-H融合蛋白,且该蛋白能与CDV阳性抗体反应,具有反应原性。     

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析

为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87 ku的重组蛋白.Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应.大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验.结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础.     

重组产气荚膜梭菌plc毒素基因植物乳酸杆菌的构建

依据乳酸菌的肠道益生作用,选择产气荚膜梭菌关键致病因子α毒素/磷脂酶C为抗原,构建产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段重组植物乳杆菌,利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western Blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,plc重组蛋白相对分子质量分别为40 kDa。重组质粒pSIP409-plc分别电转化植物乳杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明,构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌plc蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。     

镰形扇头蜱Subolesin基因的长链dsRNA电转化和干扰效果研究

为建立针对不同发育阶段蜱的长链dsRNA电转化导入方法,本研究以我国优势流行的硬蜱镰形扇头蜱为对象,以蜱的保守基因Subolesin作为目标基因,将荧光标记的Subolesin-dsRNA对卵、幼蜱以及若蜱3个发育阶段进行电转化监测dsRNA的转化效果,对电转化后不同时间以及不同dsRNA电转化浓度进行优化,并接种小鼠观察电转化Subolesin-dsRNA对幼蜱及若蜱吸血的影响。结果显示,电转化Cy3荧光染料标记dsRNA后,卵、幼蜱及若蜱体内均有点状分布的荧光。若蜱于电转化后放置8h,Subolesin mRNA沉默效果较佳。此外,卵、幼蜱及若蜱分别在dsRNA浓度为10μg/m L、5μg/m L~25μg/mL及10μg/m L~25μg/m L沉默效果较好。Subolesin-dsRNA干扰后蜱的存活率和吸血能力均显著降低。本研究建立的针对各个发育阶段蜱的高效长链dsRNA电转化方法为研究基因功能和沉默特定的基因提供了新的ds RNA导入方法。     

表达禽流感病毒NP和M2融合基因重组乳酸菌的构建及鉴定

为了在乳酸菌中表达H9N2亚型禽流感病毒（AIV）NP和M2基因并检测其反应原性,先以pMD19-T-M2质粒作为模板,采用PCR方法克隆M2全长基因,然后将M2基因亚克隆入pSIP409-pgsA′-NP质粒中,构建重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2。并将重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2通过电转化的方法转入植物乳杆菌Lb.plantarum NC8中,制备重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2。诱导表达NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2重组乳酸菌,并通过流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹技术验证。结果表明,重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2能够经诱导表达NP-M2融合蛋白,并且与兔源NP单克隆抗体和抗M2的小鼠血清具有反应原性。这为后续研究禽流感广谱口服疫苗奠定基础。     

西藏青贮用乳酸菌筛选分离及应用研究进展

西藏自治区地处青藏高原,虽然饲料原料资源丰富,但整体利用率不高。青贮处理可以有效贮存饲料,既可以节约饲料资源,也可以保存饲料中的营养成分。目前,西藏地区关于青贮用乳酸菌的研究已经由从传统乳制品中分离乳酸菌过渡到从多种天然青贮饲料中分离乳酸菌。对西藏地区青贮用乳酸菌的筛选分离及应用研究进展进行了综述,以期为加快以青贮分离乳酸菌菌株为来源的高原青贮用乳酸菌制剂的研发提供参考。     

组学技术在乳酸菌分离鉴定及功能研究中的应用

乳酸菌具有黏附宿主细胞或黏膜、抑制病原菌生长、维持机体微生态平衡、增强宿主免疫力等促进宿主健康的作用，同时在食品工业、抗菌剂生产和体内发酵中也发挥重要作用，但目前对乳酸菌发挥益生作用的具体分子机制的描述不多。为探明乳酸菌自身及其在宿主中的新功能和调控机制，可采用组学技术进行研究。根据中心法则衍生出的组学方法包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学。单组学技术在乳酸菌研究中的应用可深入探索乳酸菌发挥的功能及其作用机制。多组学技术的应用可突破单一组学技术的局限性，从不同维度综合分析乳酸菌的潜在功能，进一步预测乳酸菌自身及其在宿主中发挥的作用。作者综述了几种常用于乳酸菌分离鉴定及功能研究领域的组学技术，阐述了多组学技术在乳酸菌功能及其机制研究中的应用概况，为进一步探明乳酸菌的潜在功能提供可行的技术方法和方向。     

乳酸菌耐酸耐胆盐机制研究进展

作为一种常见的益生菌,乳酸菌需能够耐受胃液中的强酸与肠道内的高浓度胆盐,并在人体内大量存活才能发挥其益生作用。目前对乳酸菌耐酸机理的研究主要侧重于质子泵理论和产生碱的机制,另外,葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等外源物质的含量对其耐受能力也有一定影响;乳酸菌在胆盐胁迫下的抑制机制主要包括胆盐水解酶的作用、应激蛋白的作用和自身细胞膜的保护作用。本文对乳酸菌的耐酸耐胆盐机制进行了综述,并对其影响因素进行了分析和探讨。     

添加剂对羊草青贮发酵品质和体外消化率的影响

研究乳酸菌制剂、纤维素酶和甲酸对羊草(Leymus chinensis)青贮发酵品质和体外消化率的影响。结果表明:添加乳酸菌制剂、纤维素酶、乳酸菌制剂+纤维素酶均显著降低了青贮饲料pH值,提高了乳酸含量(P<0.05);添加甲酸显著降低了青贮料pH值、乳酸和氨态氮含量(P<0.05);添加乳酸菌制剂或甲酸显著提高了干物质体外消化率(P<0.05),乳酸菌制剂与纤维素酶混合添加显著提高了干物质和粗蛋白质体外消化率(P<0.05)。     

乳酸在奶牛体内的代谢途径及其对奶牛健康影响的研究进展

乳酸（lactic acid）是奶牛瘤胃内重要的中间代谢产物，合理的调节乳酸代谢特征、充分利用及发挥乳酸的有益功能对奶牛健康生产具有重要意义。文章介绍了乳酸的合成途径及主要产酸菌、乳酸的代谢途径及主要利用菌、乳酸在奶牛瘤胃内的代谢方式及影响其代谢的因素，详细阐述了乳酸产生菌与利用菌对乳酸代谢调节的影响，同时介绍了植物提取物对乳酸代谢调节作用及乳酸代谢调节对奶牛胃肠道菌群、泌乳性能和乳房炎的影响。为进一步了解乳酸对奶牛健康的作用机制及相关植物活性物质在生产实践中的应用提供理论依据，为解决高精料饲粮引起的奶牛酸中毒的预防与治疗提供新思路。     

含水量和乳酸菌添加剂对多花黑麦草青贮品质的影响

本试验旨在研究含水量和乳酸菌添加剂对多花黑麦草青贮品质的影响,探究优质多花黑麦草青贮饲料的调制方法。试验选用孕穗期的多花黑麦草为原料,原料含水量设85.23%(W₁),74.70%(W₂)和65.70%(W₃)3个水平,乳酸菌添加浓度设置对照组0 cfu/g鲜样(L₀),10⁵ cfu/g鲜样(L₁),10⁶ cfu/g鲜样(L₂),10⁷ cfu/g鲜样(L₃)4个水平。桶装青贮42 d后开盖,取样测定青贮饲料的青贮品质。结果表明,在高含水量(85.23%)的条件下,无论是否添加乳酸菌,丁酸的含量和氨态氮/总氮均未能达到优质青贮的条件,青贮失败;当含水量为74.70%时,添加乳酸菌组的青贮品质优于未添加组,且随着添加浓度的增加青贮品质更佳;在含水量为65.70%的条件下,无论是否添加乳酸菌添加剂,青贮饲料均能获得较好的青贮品质,但添加乳酸菌后效果更佳。因此,W₃L₃(含水量65.70%+10⁷ cfu/g鲜样)处理的青贮效果最佳。     

分泌抗金黄色葡萄球菌细菌素乳酸菌的分离鉴定

为分离和筛选产抗金黄色葡萄球菌乳酸菌素的优势乳酸菌,利用乳酸菌分离培养基MRS从收集的各种腌制菜汁中分离培养乳酸菌,通过细菌培养特性、革兰氏染色特点、生理生化特性初步鉴定,同时根据Genbank中乳酸菌的16SrDNA序列设计特异性引物,采用PCR方法进一步鉴定,并以金黄色葡萄球菌为指示菌对乳酸菌的发酵上清液进行抑菌特性研究。结果表明,从腌渍菜汁中分离获得90株产酸菌,通过形态学、生理生化特性和PCR鉴定,结果73株产酸菌为乳酸杆菌;分泌产物抑菌试验表明,有10株菌具有抑制金黄色葡萄球菌活性,经酸排除和过氧化氢排除试验,仍然有5株乳酸菌的分泌产物具有抑制金黄色葡萄球菌活性。可见,从腌渍菜汁分离到的乳酸菌具有抑制金黄色葡萄球菌活性的特性,主要是通过分泌乳酸菌素来发挥作用。     

益生菌及寡糖对猪肠道乳酸菌群多样性的影响

断乳初期仔猪肠道乳酸菌群多样性容易发生改变,这种改变会使仔猪变得更加易感。乳酸菌和寡糖的饲喂可以促进仔猪肠道乳酸菌群多样性的恢复,更加有利于提高仔猪对肠道疾病的抵抗性。不同的益生菌种促进肠道乳酸菌群多样性的能力不同,这就为乳酸菌的筛选提供了一种新思路。另外,不同的寡糖也可被不同的益生菌所利用,因此,益生菌与寡糖的配合应用要有所选择。     

添加剂对籽粒苋与豆粕混合青贮品质的影响

为了评价不同添加剂对籽粒苋与豆粕混合青贮品质的影响,在72%籽粒苋与28%豆粕混合青贮中分别添加糖蜜、乳酸菌、纤维素复合酶、糖蜜+乳酸菌、糖蜜+纤维素复合酶、乳酸菌+纤维素复合酶、糖蜜+乳酸菌+纤维素复合酶;以等量水为空白对照组,青贮30 d后进行开包取样并分析各项指标。结果表明,添加糖蜜、糖蜜+乳酸菌、糖蜜+纤维素复合酶或糖蜜+乳酸菌+纤维素复合酶处理组均较对照改善了籽粒苋与豆粕混合青贮的发酵品质和营养品质,显著降低了pH值、干物质损失率、洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量,显著提高了可溶性碳水化合物含量和相对饲用价值(P<0.05)。乳酸菌、纤维素复合酶及乳酸菌+纤维素复合酶处理组pH值、洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量均显著高于对照(P<0.05)。综合评价,建议籽粒苋与豆粕混合青贮时添加糖蜜或复合添加糖蜜与乳酸菌或纤维素复合酶。