长春花愈伤组织诱导

长春花(Catharanthus roseus (L.)G.Don.)是夹竹桃科植物,全草入药,据报道有抗癌作用,其主要抗癌成分为长春碱和长春新碱[1].由于含量甚微[2],价格昂贵,人工栽培远远满足不了人们的需要.诱导愈伤组织是组织培养的第一步,是进行工业化生产的基础.曾有人先后在B5[3]、White[4]、Wo-L[5]、WoNiKo5-L[6]培养基上诱导出长春花愈伤组织,且在其上的继代培养也获成功.笔者在MS培养基上对于是否能诱导出长春花茎的愈伤组织进行了的探索.     

枣树组织培养养愈伤组织诱导的研究

将枣树不同品种的不同器官及其部位的外植体接种含有不同激素的培养基中培养，对其愈伤组织诱导条件进行了条件，结果表明，灌阳长枣（中国）和普通枣（日本）为较适宜组培的品种，胚，嫩枝顶部，芽为适宜组培的器官；以ＭＳ（１／２ＮＯ＾－３）的作基本培养基，并添加３μｍｏｌ左右Ｚｅａｔｉｎ和约３０μｍｏｌＮＡＡ或ＩＡＡ可以获得数量较多，质量较好的愈伤组织，叶所产生的愈伤组织颜色较深，数量也较少，并在初代培养时易产     

高粱不同外植体愈伤组织诱导的研究

取几种高粱类型的不同外植体在MS培养基上进行愈伤组织诱导培养,影响外植体愈伤组织形成和生长的因素很多,本试验结果表明:不同基因型间愈伤组织诱导率有差异.耐性(耐旱)品种形成愈伤组织能力较强.不同外植体间诱愈率差别较大,幼穗诱愈率最高88.O%,花药最低1%左右.另外,幼叶诱愈培养对盐反应敏感.在成熟胚培养过程中,其诱愈率为63.O%,并获得8棵成株.     

臭柏愈伤组织的诱导

在离体培养条件下,取当年生臭柏（Ｓａｂｉｎａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）茎尖、茎段、叶及根尖为外植体,在ＳＨ、ＭＳ培养基上获得愈伤组织。结果表明：在试验的４种外植体中,以茎尖脱分化能力最强,并筛选出愈伤组织最佳培养基为：ＳＨ＋ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ１．０ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ。植物本身的生态生物学特性与臭柏的愈伤组织的诱导成功与否有很大关系。     

山核桃愈伤组织诱导的初步研究

采用正交设计研究了不同植物激素配比、蔗糖质量浓度、外植体取材部位以及单宁含量等因素对山核桃组织培养中愈伤组织形成的影响。结果表明：WPM＋BA8．0mg.L^-1 IB2.0mg.L^-1 GA1.0mg.L^-1＋蔗糖30mg.L^-1是最适培养基；顶芽和第4芽段为较适宜的山核桃愈伤组织诱导的取材部位；不同芽段愈伤组织的形成率与其单宁含量不相关，而与芽段愈伤组织形成的部位有关，且随着单宁含量的减少。愈伤组织形成的部位向切口上升。选取1年生实生苗茎尖和茎段，配比合理的植激素加以诱导，可提高山核桃嫁接成活率。表5参11。     

除虫菊愈伤组织诱导研究

以除虫菊种子获得的无菌苗的不同器官为外植体,研究几种基本培养基及NAA、2,4-D或其与BA、KT的组合对愈伤组织的诱导效果,结果表明：不同类型基本培养基中MS有利于子叶、真叶和下胚轴,White有利于根愈伤组织的诱导和生长。不论除虫菊的哪一部分作为外植体,培养基pH值均为5.8较为合适。不同器官外植体诱导愈伤组织的最适植物生长调节剂组合不同,子叶为1.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L KT,真叶为1.0-2.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/LKT,根为0.5 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L BA或KT,而下胚轴在1.0-2.0mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L BA,0.5-1.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L KT,1.0 mg/L NAA＋0.5 mg/L BA,0.5mg/L NAA＋0.5 mg/L KT,0.5 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L BA或KT均可100%诱导愈伤组织。     

茶树花药愈伤组织诱导及增殖研究

以茶树花药为外植体,以MS培养基为基本培养基,探究适合花药愈伤组织诱导的花药发育时期,不同光照时间对花药愈伤组织诱导的影响,不同植物生长调节物质对花药愈伤组织诱导及增殖的影响,为建立茶树组织培养体系提供依据。研究结果表明：利于花药愈伤组织的形成的处于单核中期的花蕾直径在0.7～0.8 cm,黑暗条件下较12 h/d光照条件下茶树愈伤组织的诱导率高,茶树花药经过低温预处理24 h后,在培养基MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.4 mg/L+2,4-D1.0 mg/L上愈伤组织诱导率最高,诱导率为84.6%,茶树花药愈伤组织增殖率最高的培养基为MS+NAA1.0 mg/L+6-BA0.5 mg/L+2,4-D0.2 mg/L。     

大叶黄杨幼茎愈伤组织诱导的研究初报

 以大叶黄杨的幼茎段为外植体,在添加BA和NAA、IBA、2,4-D不同激素组合的MS培养基上培养,对其愈伤组织进行诱导试验。结果表明：①生长素对愈伤组织诱导的效应为2,4-D >NAA>IBA;②在不同激素组合培养基上均可诱导出愈伤组织,其中MS+BA1.0~2.0 mg/L+NAA 1.0~1.5 mg/L、MS+BA1.5~2.0 mg/L+IBA1.0~1.5 mg/L、MS+BA0.5~1.0 mg/L+2,4-D 0.5~1.5 mg/L等对愈伤组织的诱导效果最好,其诱导率分别为74.3%、65.3%、81.1%。因此,通过科学配制不同激素组合的MS培养基,就能有效地诱导出大叶黄杨幼茎的愈伤组织。     

连香树愈伤组织诱导研究

[目的]为珍稀濒危树种连香树寻求组培快繁方法。[方法]以1/4MS、1/2MS、MS添加不同浓度的NAA、KT、GA3为培养基,以连香树当年生带芽茎段为外植体进行愈伤组织诱导。[结果]以4月份采集的带芽茎段作为外植体愈伤组织诱导效果相对较好;在1/4MS+NAA 1.0 mg/L+KT 0.2 mg/L+GA31.00 mg/L培养基中愈伤组织诱导效果相对较好,但总体而言愈伤组织诱导率较低。[结论]连香树愈伤组织诱导具有可行性,需进一步研究。     

雷公藤非生物碱分离及对粘虫作用方式研究

提取、分离了雷公藤 (Tripterygium wilfordii Hook)根皮中非生物碱物质 ,经鉴定其主要成分为总萜内酯 ,含量为 10 5 .3g/ kg。以粘虫为试虫 ,对非生物碱物质杀虫活性和作用方式进行了系统的生物测定。结果表明 ,非生物碱对粘虫具有拒食、毒杀、麻醉、触杀和杀卵作用。拒食中质量浓度 AFC50 为 5 0 .2 6 m g/ L;毒杀中质量浓度 L C50 为 34.72 mg/ L,麻醉中量 N D50 为 13.45 μg/ g,触杀中量 L D50 为 3.5 4μg/头 ,在非生物碱质量浓度为 0 .5～2 0 g/ L 时 ,34%～ 6 5 %的粘虫卵不能孵化。     

具杀虫活性雷公藤内生菌的分离与筛选

以卫矛科植物雷公藤的根、茎、叶为材料分离得到内生菌183株,其中真菌111株,放线菌23株,细菌49株。雷公藤植株的不同组织部位的内生菌数量有较大的差异,雷公藤根中分离得到的内生菌最多(89株),占总数的48.63%,叶部次之(72株),占总数的39.35%,茎部分离得到的内生菌最少(22株),占总数的12.02%。以卤虫、蚊幼及蚜虫为试虫,对183株内生菌的杀虫活性进行筛选,得到3株对蚜虫具有较高毒杀活性的菌株。其中菌株11-6-76的胞内和胞外代谢物均具有较高的杀蚜活性,蚜虫的死亡率分别为78.64%和70.75%;菌株11-3-37和12-2-47的胞内代谢产物提取物对蚜虫的毒杀活性较高,蚜虫死亡率分别为82.74%和76.97%。菌株11-3-37、11-6-76和12-2-47胞内代谢产物粗提物对蚜虫的LC_(50)分别为34.8mg/mL、31.2mg/mL和46.4mg/mL。     

雷公藤总生物碱分离及杀虫活性研究

提取、分离了雷公藤 (Tripterygium wilfordii Hook)根皮中总生物碱 ,并对其杀虫活性和作用方式进行了系统的生物测定。结果表明 ,雷公藤总生物碱对 5龄菜青虫有很强的麻醉、拒食和毒杀作用 ;拒食中浓度AFC5 0 为 2 75 .5 3m g/L,毒杀中浓度 L C5 0 为 77.86 m g/L,麻醉中量 ND5 0 为 2 .2 9μg/g;雷公藤总生物碱无触杀和熏蒸作用。试虫中毒症状主要为幼虫表皮出现黑斑 ,形成黑斑部分不能脱去旧表皮 ,最终死亡     

雷公藤生物碱对土壤微生物的影响

安全性评价是新农药开发及应用的重要基础。参照国家环保总局和农业部农药检定所制定的《化学农药环境安全评价试验准则》,测定95%雷公藤总生物碱和1.0%雷公藤生物碱微乳剂对土壤微生物的毒性。结果表明,95%雷公藤总生物碱和1.0%雷公藤生物碱微乳剂对土壤微生物的呼吸有明显促进作用;雷公藤生物碱在低剂量下,对果园和麦田土壤微生物的硝化作用无明显影响,但在200 μg/g剂量下,有明显抑制作用;在2、20和200 μg/g剂量下,对果园和麦田土壤微生物的氨化均有显著的促进作用;雷公藤生物碱对土壤真菌有一定的抑制作用,但其投毒系数均小于5;雷公藤生物碱对2种不同土壤中的放线菌、固氮菌无抑制作用。由上述结果可见,95%雷公藤总生物碱和1.0%雷公藤生物碱微乳剂对土壤微生物低毒。说明雷公藤生物碱对土壤环境较为安全。     

雷公藤生物碱制品对小菜蛾和菜青虫的控制效果

测定了雷公藤总生物碱对小菜蛾和菜青虫的室内毒力,以及0.1%雷公藤生物碱乳油对两种害虫的田间防效。结果表明,雷公藤总生物碱对小菜蛾3龄幼虫48和72 h的LC50值分别为228.28和136.67 m g/L,对菜青虫5龄幼虫48和72 h的LC50值分别为307.61和238.18 m g/L;1.0%雷公藤生物碱乳油对小菜蛾的毒杀作用较强,其48和72 h的LC50值分别为69.62和20.35 m g/L,对菜青虫48和72 h的LC50值分别为93.18和44.62 m g/L。250倍稀释的雷公藤生物碱乳油(有效含量为40 m g/L)田间喷雾处理对小菜蛾和菜青虫均具有较好的防治效果,施药后7 d的防治效果分别为82.93%和82.71%,在本试验剂量范围内对作物安全。可见,雷公藤生物碱制品对两种蔬菜害虫控制效果显著。     

杜仲愈伤组织诱导的研究

采用杜仲优树的幼叶、嫩茎及种子无菌苗的下胚轴、子叶、真叶、根为外植体,以B5和MS为基本培养基,添加1.0mg/LNAA和0.3mg/LBA,进行了不同外植体种类、外植体大小、试验接种方式、外植体采样时间、光照条件、培养基pH值共6种因素对杜仲愈伤组织诱导的影响试验。结果表明,在杜仲愈伤组织诱导中,田间材料幼叶取样时间以3月中旬为好,幼茎的取材时间以4月中旬以前最佳;无菌苗以下胚轴、子叶、真叶诱导效果较好;诱导愈伤组织的培养基pH值以6.3较适宜;培养室的光照条件以12h光照、12h暗培养较有利于愈伤组织诱导;茎段的大小和接种方式以0.7cm长度横放方式诱导效果较好。     

雷公藤ISSR反应体系的建立与优化

[目的]建立适合雷公藤的ISSR-PCR反应体系,为雷公藤种质资源的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析提供技术支持.[方法]采用单因素试验设计优化影响雷公藤ISSR-PCR扩增效果的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物浓度和DNA模板含量及退火温度,并以32份雷公藤样品对优化的ISSR-PCR反应体系进行验证.[结果]优化的雷公藤种质资源ISSR-PCR反应体系为:20.00μL反应液中含1.50 U Taq DNA聚合酶、0.30 mmol/L dNTPs、2.00 mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、20 ng DNA模板和2.00μL 10×Buffer.ISSR-PCR扩增程序中最佳退火温度为54.7℃.[结论]建立优化的雷公藤ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性、重现性和适用性,可应用于雷公藤不同地理种源间的遗传多样性鉴定.     

雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫杀灭活性和谷胱甘肽硫转移酶的影响

【目的】研究雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫的杀灭活性、谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性以及GST相关基因表达的影响。【方法】以摇蚊4龄幼虫为试虫,分别用5,10,15μg/L雷公藤总生物碱进行处理,以用丙酮处理为对照,24~72 h后观察幼虫反应,测定雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫的致死中浓度(LC50)及谷胱甘肽硫转移酶活性,并用RT-PCR方法,检测了摇蚊11个GST基因的表达情况。【结果】雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫具有杀灭活性,24,48,72 h的致死中浓度(LC50)分别为33.019,19.092和16.760μg/L。在亚致死质量浓度(5,10,15μg/L)下,雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫谷胱甘肽硫转移酶活性具有显著的抑制作用,与同期对照相比,酶活性最大下降幅度分别为73.49%(以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)为底物)和73.20%(以3,4-二氯硝基苯(DCNB)为底物)。RT-PCR检测结果显示,在摇蚊11个谷胱甘肽硫转移酶基因中,有2个基因(CtGSTu3和CtGSTu4)在mRNA水平上被诱导上调表达,且mRNA表达量随着雷公藤总生物碱质量浓度的增加而升高,存在着剂量依赖关系。【结论】雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫具有较高的杀灭活性,有被开发为摇蚊控制剂的潜能。在亚致死质量浓度(5~15μg/L)处理下,雷公藤总生物碱能显著抑制摇蚊谷胱甘肽硫转移酶活性,并诱导CtGSTu3和CtGSTu4 mRNA上调表达。     

雷公藤叶片基因组DNA不同提取方法比较

[目的]比较雷公藤叶片中基因组DNA的提取方法。[方法]采用常规CTAB法、改良CTAB法、常规SDS法、高盐低pH值法和一步法分别提取雷公藤叶片基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法测定样品OD260与OD280的比值以及RAPD扩增结果,判断所得DNA样品的纯度,并根据OD260值计算不同提取方法的DNA得率。[结果]改良CTAB法提取效果最佳,所提DNA的平均得率为219.3μg/g,OD260/OD280比值在1.869～1.903,用于RAPD-PCR均有较好的扩增结果。[结论]改良CTAB法是雷公藤叶片基因组DNA提取的最佳方法。     

雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达

【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶HMGR的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据GenBank中报道的限速酶HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cDNA全长序列;用生物信息学方法对限速酶HMGR进行蛋白结构及功能分析;用半定量RT-PCR方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用HPLC分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶HMGR的基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框长为1 860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT)及2个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEG-CLVA)。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤HMGR蛋白可能为甲羟戊酸(MVA)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。