Ⅰ型牛疱疹病毒活载体疫苗的构建及研究进展

I型牛疱疹病毒(BHV-1)可引起牛的呼吸道疾病、生殖道损害、流产甚至致死性系统感染,给养牛业造成了严重的经济损失,疫苗接种是防治本病的主要措施。文章介绍了其活载体疫苗的构建原理、研究进展及应用前景方面内容。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu／67株的MDBK细胞中扩增gD基因，将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析，设计合成3对引物，以获得的克隆质粒为模板，PCR扩增gD胞外域基因，将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ、pET—gDQB、pET—gDHB，利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21（DE3），IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小，Western blot表明表达产物均有抗原性。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

病毒感染对Ⅰ型和Ⅱ型细胞凋亡影响的研究

细胞凋亡是多基因严格控制的过程如Bcl-2家族、胱冬酶家族、c-myc、P53等.随着分子生物学技术的发展,人们对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识,但是病毒家族对机体感染过程中对凋亡发生和抑制的过程确切机制尚不完全清楚.该研究将集中阐述与经典的细胞凋亡和副凋亡相关的信号转导途径和病毒蛋白参与其中的多种调节因子的作用机理.     

中药制剂“病毒宁”抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的活性

本试验研究了中药制剂“病毒宁”在体外对单纯疱疹病毒(HSV-1)增殖的抑制作用。结果显示:“病毒宁”在1.500~0.188 g/L稀释浓度下,对HSV-1有直接杀灭作用(P<0.05);“病毒宁”在1.500~0.375 g/L稀释浓度时,能显著阻断HSV-1对BKH-21细胞的感染(P<0.05),并显著抑制病毒在细胞内的增殖(P<0.05);中药制剂“病毒宁”在体外具有明显的抗HSV-1作用,其最大无毒浓度为1.500 g/L。     

构树黄酮诱导肝癌细胞凋亡的初步观察

[目的]研究构树黄酮对肿瘤细胞的抑制效果。[方法]将处于对数生长期的Hep G2细胞接种于含有0、25、50、100、200、300μg/ml构树黄酮的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2条件下分别培养24、48和72 h,采用MTT法测定构树黄酮对Hep G2细胞增殖的影响、用碘化丙啶(PI)染色法观察细胞形态的变化,并计算Hep G2细胞凋亡率。[结果]构树黄酮能显著抑制Hep G2细胞增殖,并呈现剂量和时间依赖性;构树黄酮能诱导Hep G2细胞凋亡,其最低有效浓度为25μg/ml;且Hep G2细胞凋亡率呈随着构树黄酮浓度增加及作用时间延长而升高。[结论]构树黄酮能抑制Hep G2细胞增殖并诱导其凋亡。     

猪传染性胃肠炎病毒诱导ST细胞凋亡的初步研究

【目的】探讨猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪睾丸细胞(ST细胞)后是否可诱导细胞发生凋亡,并对凋亡的信号通路进行初步探究,为进一步揭示TGEV的致病机制提供理论基础。【方法】用TGEV感染对数生长期的ST细胞,同时设立对照组,在感染后不同时间取细胞样品,通过细胞形态观察、细胞活性检测、细胞凋亡率检测和细胞内Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性检测及Western blot分析等方法,研究TGEV感染对ST细胞的影响。【结果】TGEV感染可抑制ST细胞生长,并且呈现病毒感染剂量和感染时间的依赖性。倒置显微镜和荧光显微镜观察结果显示,10MOI(感染复数)的TGEV感染24h后,ST细胞出现典型的凋亡特征,细胞皱缩变圆、聚堆,细胞核内染色质固缩。流式细胞仪检测及Caspases活性检测表明,感染TGEV的ST细胞凋亡比例随感染时间的延长而逐渐增加,细胞内Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性逐渐升高。Western blot分析表明,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9无活性的酶原形式随着TGEV感染时间的延长逐渐降解,同时Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化片段逐渐增加。TGEV感染能够促进FasL和Bax的表达而下调Bcl-2的表达。【结论】TGEV感染能够诱导ST细胞凋亡,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9及FasL介导的死亡受体通路和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡通路,在调控TGEV感染诱导的细胞凋亡过程中可能起着非常重要的作用。     

水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡的初步研究

采用倒置相差显微镜、电子显微镜、琼脂糖凝胶电泳等技术研究水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞凋亡．形态学观察结果显示,水泡性口炎病毒感染BHK-21细胞的形态变化具有较典型的凋亡特征,如细胞膜内陷、核染色质凝集边聚等;琼脂糖凝胶电泳出现180-200bp整倍数的DNA梯形带．上述结果表明水泡性口炎病毒可诱导BHK-21细胞凋亡。     

铝诱导蚕豆气孔保卫细胞凋亡研究

植物叶表面的气孔保卫细胞是研究信号转导的模式实验系统,对环境变化反应灵敏而准确,采用蚕豆叶面气孔保卫细胞,研究了铝(AlCl3)对细胞的毒性效应.结果表明,在1～10mmol·L-1范围内,AlCl3可使气孔保卫细胞活性降低,部分细胞死亡,且随着浓度的增高细胞死亡率增高;死细胞呈现核固缩、核降解、凋亡小体等典型凋亡特征.凋亡抑制剂z-Asp-CH2-DCB或TLCK与AlCl3共同作用时,保卫细胞死亡率显著降低;一定浓度的抗坏血酸(AsA)或过氧化氢酶(CAT)以及Ca2+螫合剂乙二醇四乙酸酯(EGTA)或Ca2+通道抑制剂LaCl3与AlCl2共同作用时,细胞死亡率降低.研究结果表明,铝诱导的蚕豆保卫细胞死亡可能是一种细咆凋亡过程,由胁迫诱发的活性氧介导,通过激活质膜钙通道,引起胞内Ca2+水平改变,进而介导细胞凋亡.     

紫草素诱导乳腺癌细胞凋亡的研究

以MTT法测定紫草素对乳腺癌细胞株MCF-7等的生长抑制作用,并通过形态学分析、Hoechst荧光染色、流式细胞术及免疫印迹等观察紫草素诱导乳腺癌细胞凋亡的形态学、生化特征改变及凋亡的可能机制.结果表明:紫草素对乳腺癌细胞株有显著抑制生长作用,效应呈时间和剂量的依赖性,24h半数抑制浓度(IC50)均在10μmol·L-1以下.紫草素诱导MCF-7等乳腺癌细胞发生典型的细胞凋亡,细胞周期阻滞于S期,凋亡过程中产生了85ku大小的PARP裂解片段,此效应可被广谱caspase抑制剂抑制,表明紫草素可能经caspase途径诱导MCF-7细胞发生凋亡.     

卵丘细胞凋亡与增殖对牛卵母细胞体外发育的影响

 【目的】探讨卵丘-卵母细胞复合体（COCs）形态、卵丘细胞凋亡与增殖状态和卵母细胞发育能力之间的相关性。【方法】根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞层数等形态指标,对所挑选的未成熟COCs进行分组,随后利用体外受精技术和TUNEL技术,并结合流式细胞仪,评价各组COCs的体外发育能力及其卵丘细胞凋亡和细胞周期差异。【结果】 与包被5层以上致密卵丘且卵胞质均质的COCs相比,具有2—5层轻度扩散卵丘与颗粒化卵质特征的COCs显示较好的后续胚胎发育潜力、较高的卵丘细胞凋亡程度和较低的G2-M期细胞比率。【结论】 卵丘细胞凋亡程度与未成熟卵母细胞发育潜能呈正相关;COCs形态、卵丘细胞凋亡或者G2-M期细胞比率指标可以用来指示未成熟卵母细胞的发育潜力。     

低浓度紫杉醇诱导A549细胞凋亡研究

采用0、1．5、3、6nmol／L紫杉醇处理A549细胞,建立低浓度紫杉醇诱导非小细胞肺癌凋亡模型．分别采用流式细胞术、细胞计数和免疫印迹法分析细胞凋亡、细胞增殖和Bcl-2家族凋亡相关分子的表达。结果表明,低浓度紫杉醇以浓度和时间依赖的方式诱导细胞凋亡并上调Bim分子表达,而对Bcl-2家族其他凋亡相关分子无显著影响。     

牛AsiaⅠ型口蹄疫克隆纯化疫苗的免疫效果检验

对牛AsiaⅠ口蹄疫克隆纯化疫苗的物理性状和无茵进行检验;采用豚鼠和小白鼠进行安全检验;并应用该疫苗在黄牛体内进行免疫效力检测。结果表明,应用克隆毒株研制的油乳剂灭活疫苗为乳白色。稳定、稀薄、无茵、安全而且在免疫效力方面克隆口蹄疫AsiaⅠ_AKT03毒株疫苗的PD50比普通疫苗提高2．4倍。     

肉鸽圆环病毒、腺病毒及疱疹病毒Ⅰ型混合感染的多重PCR检测

运用多重PCR同时检测肉鸽病原(圆环病毒、腺病毒及疱疹病毒Ⅰ型)的方法,分别设计与合成3种病毒基因扩增引物,并提取疑似病鸽的肝脏样品DNA、进行单一PCR扩增及基因序列测定,结果分别获得了大小为239、418、618 bp的DNA产物.通过摸索多重PCR反应条件,应用多重PCR同时检测3种病毒基因片段,同时获得了鸽疱疹病毒Ⅰ型、鸽圆环病毒及鸽源腺病毒的基因片段.再对疑似混合感染这3种病毒的肝脏样品进行检测,发现50％(6/12)样品存在3种病毒的混合感染、25％(3/12)样品存在鸽圆环病毒和鸽源腺病毒的混合感染、8.3％(1/12)样品存在鸽源腺病毒和Ⅰ型鸽疱疹病毒的混合感染、8.3％(1/12)样品存在鸽圆环病毒和Ⅰ型鸽疱疹病毒的混合感染、8.3％(1/12)样品未发生任何感染.结果表明,多重PCR可快速检测鸽疱疹病毒Ⅰ型、鸽圆环病毒及鸽源腺病毒的混合感染,表明运用三重PCR检测3种病毒混合感染有很好的应用价值.     

低温诱导淡水白鲳细胞凋亡的研究

为探讨10℃低温导致淡水白鲳尾鳍细胞系CBT死亡的原因及其可能机制.采用CCK-8试剂盒法检测细胞存活率,荧光染料H2DCFDA染色测定细胞内活性氧(ROS)含量,亚二倍体峰和Tunel分析检测细胞凋亡,琼脂糖凝胶电泳进行DNA片段分析,Hoechst33258染色观察凋亡细胞核形态变化,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放率.结果表明随CBT细胞受10℃低温作用时间的延长,细胞存活率显著下降,细胞内ROS含量和LDH释放率显著增加(P＜0.01).低温处理3 d的CBT细胞经流式细胞仪检测出现亚二倍体峰,凋亡率为13%.再经32℃复温12 h后,琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯带;Tunel检测,低温处理3、4和5 d的CBT细胞分别有23.49%,27.72%和35.10%发生凋亡.低温处理5 d的CBT细胞核分裂成多个小核,呈现出典型的凋亡小体.因此10℃低温能诱导CBT细胞凋亡.ROS参与了10℃低温致CBT细胞损伤及凋亡过程.     

激光诱导细胞凋亡的研究概况

综述了低强度激光的生物刺激作用诱导细胞凋亡以及以激光为光源的光动力治疗诱导细胞凋亡的研究概况及临床应用前景。     

牛传染性鼻气管炎的辩证施治

牛传染性鼻气管炎是牛的一种急性、热性、接触性传染病，其特征是鼻道、气管黏膜发炎，出现发热、咳嗽、流鼻液和呼吸困难等症状，有时伴发结膜炎、阴道炎、龟头炎、脑膜炎或肠炎，也可发生流产。本病呈世界性分布，其病原体是牛疱疹病毒Ⅰ型，由于本病目前缺乏特效药物，病畜死亡率较高。笔者在实践中，根据中医理论对本症进行辩证论治，取得了较好的疗效，现总结如下。     

紫外线诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1的凋亡研究

UVB诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1不同时间后,用四氮唑盐法(MTT)和Hoechst染色及DNA-Ladder法分别检查BmE-SWU1细胞的增殖活性和凋亡情况.该实验研究了紫外线诱导对家蚕胚胎细胞BmE SWU1凋亡的影响,建立了紫外线诱导家蚕细胞凋亡的简单模型,为家蚕变态发育过程中细胞凋亡的研究奠定了基础.结果表明:UVB处理家蚕BmE-SWU1细胞后,细胞增殖活性随着照射剂量的增加而逐渐降低;光学显微镜下可见细胞膜表面突出或出现小泡,经Hoechst染色后,凋亡小体在荧光显微镜下清晰可见,细胞DNA电泳条带呈梯形分布,这是凋亡细胞典型的生化特征.