苹果茎沟病毒吉林沙果分离物全基因组序列分析

通过RT-PCR结合RACE技术扩增到苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）吉林沙果分离物（ASGV-JLSG）全长基因组（登录号：FM616381）,共含有6 496个核苷酸（nt）,编码两个彼此重叠的开放阅读框（Open reading frame,ORF）。ORF1（37 ~ 6 354 nt）编码1个241 kD的多聚蛋白,含有甲基转移酶（Methyltransferase）、木瓜蛋白酶（Papain-like-protease）、解旋酶（Nucleotide triphosphate-binding helicase）、RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）和C端的外壳蛋白（Coat protein,CP）等结构域。ORF2（4 788 ~ 5 750 nt）编码1个36 kD的运动蛋白（Movement protein,MP）。ASGV-JLSG分离物与GenBank公布的29个ASGV分离物全基因核苷酸序列一致性为79.20% ~ 86.60%。系统发育分析结果表明,30个ASGV分离物分成2个组,分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律。重组分析发现,ASGV-JLSG分离物是苹果茎沟病毒黄花梨分离物（ASGV-HH,JN701424）和柑橘碎叶病毒满头红分离物（CTLV-MTHK,C588948）的重组体。本研究中获得的ASGV-JLSG分离物基因组是来源于中国东北地区的首个ASGV基因组序列。     

草莓白化相关病毒中国分离物全基因组分析

草莓白化相关病毒(strawberrypallidosis-associatedvirus,SPa V)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus),可引起草莓病害,2017年在中国首次报道。采用高通量测序、RACE和RT-PCR技术获得了SPa V中国分离物(FJ)的基因组全长。该病毒含有两条正单链基因组RNA1和RNA2。RNA1全长8 048 nt,5′和3′非编码区序列分别为264和197 nt,含有3个开放阅读框(ORF),分别编码ORF 1a/1b融合蛋白和p9蛋白。RNA2全长7 977 nt,5′和3′非编码区序列分别为248和186 nt,含有8个开放阅读框(ORF),分别编码HSP70h、CPh、CP、CPm、p7、p6、p9和p28等8个蛋白。RNA1和RNA2与美国M1分离物分别具有98.5%和99.0%的核苷酸一致性;系统发育分析结果表明,SPa V中国分离物(FJ)单独处在一个分支。对SPa V来源的小RNA的分析表明,来源于SPa V的小RAN长度以21和22 nt为主。     

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物, 采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段, 分别克隆到pMD-18T载体并测序。结果表明, 本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基, 可编码218个氨基酸, 它们之间的核苷酸序列同源性较高, 达92.8% ～99.1%; 将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较, 显示出与CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%, 而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%。因此, 这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ。     

李属坏死环斑病毒辽宁桃树分离物基因组分析

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)辽宁桃树分离物全长基因组。用Vector NTI Advance 11软件进行基因组结构注释。用SDTv.1.0软件分析该分离物与Gen Bank中公布的其他PNRSV分离物间的核酸一致性,并用MEGA5.0软件和RDP3软件对各PNRSV分离物进行系统发育分析和重组分析。结果显示:PNRSV辽宁桃树分离物基因组由3条正义单链RNA组成。RNA1由3 332个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 30~3 167),编码一个约117.0k D的复制酶相关蛋白P1。RNA2由2 591个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 27~2 426),编码一个约99.0 k D的复制酶相关蛋白P2。RNA3由1 943个核苷酸构成,具有两个互不重叠的开放阅读框分别编码一个运动蛋白(nt 175~1 026)和一个外壳蛋白(nt 1 100~1 774),这两个开放阅读框的间隔区为73个核苷酸。PNRSV辽宁桃树分离物的RNA1、RNA2和RNA3与其他已经公布的PNRSV分离物间,核酸序列一致性分别为91.8%~98.8%,93.3%~99.2%和87.7%~99.0%。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列构建的系统发育进化树,分别将已报道的PNRSV分离物划分为3个、2个和3个组,PNRSV辽宁桃树分离物分别属于RNA1Ⅰ组、RNA2Ⅰ组和PV96组。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列进行的重组分析表明各PNRSV分离物基因组间不存在重组。PNRSV辽宁桃树分离物基因组序列是世界首个来源于桃树的PV96组基因组序列。     

新疆、甘肃和河南部分地区甜瓜瓜类蚜传黄化病毒分子变异初步分析

从新疆鄯善县、甘肃瓜州县和河南通许县采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)症状的甜瓜叶片样品63份,利用反转录PCR(RT-PCR)检测,从阳性样品中选取25个分离物扩增出1.4 kb的片段,并对其序列进行分析。结果表明:63份样品中,36份为CABYV阳性;获得的序列包括部分3′端的依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因、非编码区(NCR)和全长外壳蛋白(CP)基因。随机选取25个分离物的CP基因与GenBank中的序列进行比对,其序列相似性为93.2%~100%。通许分离物间序列相似性为98.8%~99.8%,瓜州分离物间序列相似性为98.2%~100%,鄯善分离物间序列相似性为99.2%~100%,组内表现出极高的同源性。基于其部分RdRp基因、NCR及CP基因序列构建的系统进化树表明:25个CABYV分离物与中国及周边地区(泰国、韩国等)的分离物聚为一簇,而与欧洲地区分离物距离较远,说明了该病毒分子变异与分离物的地理分布有关。     

侵染番茄的黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯S病毒CP基因克隆及序列分析

以山西省晋中地区表现褪绿黄化、卷曲、叶脉变黑症状的番茄植株叶片为试材,采用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(Sequence-independent amplification,SIA)方法,对侵染番茄病样的病毒病原进行检测,以期为山西省番茄病毒病的防治提供参考依据。结果表明:该病样由黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯S病毒(PVS)3种病毒复合侵染,将其分别命名为CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ。为明确CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ的分类地位,进一步克隆到了这3个病毒的CP基因序列并进行相似性比较,发现CMV-SXFQ与CMV各亚组代表株系相似性为74.9%~98.8%,氨基酸序列的相似性为82.5%~99.5%;TMVFQ与TMV代表株系相似性为74.4%~99.8%,氨基酸序列的相似性为83.6%~100.0%;PVS-SXFQ与PVS代表株系相似性为93.2%~99.3%,氨基酸序列的相似性为92.4%~100.0%;系统进化分析表明:CMV-SXFQ分离物与亚组ⅠB的CH、HLJ、XJ2、Am、As株系亲缘关系最近;TMV-FQ分离物与IM、Jimo、SXFQ株系亲缘关系最近;PVSSXFQ分离物与Cm、St株系亲缘关系最近。     

萝卜中一种新dsRNA的全长cDNA克隆及序列分析

 从一点红萝卜品种（Raphanus sativus-root cv. Yidianhong）叶片中提取dsRNA,应用SPAT方法对各dsRNA条带进行cDNA克隆并测序,除获得先前报道的5条序列（RasR1-RasR5）以外,还得到一条新的全长序列,将其定名为RasR 6（EU285027）。序列分析结果表明：RasR 6全长为1 778 bp,其正义链编码1个由502个氨基酸组成、分子量约为55.1 kDa的蛋白质。该序列与前人报道的双分病毒科5个病毒序列具有相似性,且它们均编码双分病毒科病毒的外壳蛋白(CP,Capsid protein)。核苷酸序列比对结果显示：RasR 6与同时来源于萝卜的RasR 1和RasR 2的5'UTR序列高度同源,且其3'末端具有poly A结构,而与RasR 3、RasR 4和RasR 5的UTR则没有明显的相似性。因此,我们推测RasR 6与RasR 1、RasR 2同属于双分病毒RasV 1（Raphanus sativus virus 1）,它可能与RasR 2共同编码该病毒的CP或作为RasV 1的卫星RNA存在。     

杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析

以陕西杨凌番茄生产基地感病（TYLCV 症状）番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl（GenBank 序列号：KC293824,未公布）;克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明：获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒（TYLCV-Yl）分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79～97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组：TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
（TYLCV-Yl）属于TYLCV 亚组Ⅰ。     

陕西杨凌地区TYLCV病毒生物信息学分析研究

采集杨凌五泉、揉谷和李台3个番茄主产区表现矮化、黄化及曲叶症状的植株嫩叶,克隆番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)基因全长并测序,依次得到病毒分离物TYLCV-SXYL2、TYLCV-SXYL3和TYLCV-SXYL4。通过多序列比对、系统发育树构建及蛋白质结构和理化性质预测等生物信息学方法进行基因组和蛋白质的特征分析,结果表明,杨凌区3个TYLCV分离物之间全长核苷酸相似度为99.3%~99.4%,是不伴随卫星分子的单组分病毒,属TYLCV-IS株系的不同分离物,全长为2 781 nt;与山东寿光病毒分离物TYLCV-SDSG亲缘关系最近,相似度为99.6%,与陕西泾阳的分离物TYLCV-SX8相似度为99.1%,与以色列株系TYLCV-IS相似度达97.7%~97.8%;编码6个蛋白质,其中CP、Rep、REn为跨膜蛋白,V2、TrAP、C4为胞内蛋白,Rep和REn为稳定蛋白,CP、V2、TrAP、C4为不稳定蛋白。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

羽衣甘蓝花粉SCR13-b基因的分离及其功能分析

 以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala) S_13-bS_13-b自交不亲和系为试验材料, 分离了控制花粉自交不亲和基因———S_13-b单倍型富含半胱氨酸基因(SCR_13-b) , GenBank收录号为EF577028。SCR_13-b cDNA序列含有237 bp的开放读码框(ORF) , 编码一个含78个氨基酸的蛋白。SCR_13-b gDNA含有一个758 bp的内含子, 内含子5′供体位点和3′受体位点边界序列符合GU2AG规则; DNA blot分析表明SCR_13-b在基因组中只有单一拷贝; 授粉生物活性分析试验显示原核表达SCR132b融合蛋白能够启动SI反应, 抑制杂交亲和花粉的萌发和生长。     

侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物（ChiVMV-GD）的基因组全序列,结果表明,除poly（A）尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白（位于167 ~ 9 436 nt）,5′–非编码区（5′-UTR）和3′–非编码区（3′-UTR）分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白（VPg）,3′–末端含有poly（A）尾。序列同源性分析结果表明：ChiVMV-GD与ChiVMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1% ~ 96.9%,其中与来自中国海南分离物（登录号：GQ981316.1）的同源率最高（96.9%）。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。     

滇黑两省黄瓜花叶病毒南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

 利用免疫捕捉多聚酶链式反应( Immuno-Capture PCR, IC-PCR) 方法从南瓜的两个黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 云南分离物(CMV-YN) 和黑龙江分离物(CMV-HLJ ) 中扩增获得约700 bp的外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因片段, 并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明, CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物CP基因长为657 bp, 编码219个氨基酸, 两个分离物的核苷酸和氨基酸同源性分别达到96.8%和97.4%。和国外CMV亚组Ⅰ 6个分离物核苷酸序列同源性在90%以上, 氨基酸同源性在97%以上, 和亚组Ⅱ 6个分离物的同源性分别为66.4%和73.4%。和国内亚组Ⅰ10个分离物的核苷酸同源性都在89.5%以上, 氨基酸同源性在93%以上, 而和亚组Ⅱ两个分离物的同源性分别为68.3%和73.5%。序列分析结果表明CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物属于CMV亚组Ⅰ。     

辣椒CMV广州分离物的鉴定及辣椒材料抗病性筛选

应用RT-PCR方法从黄瓜花叶病毒广州分离物CMV-GZ中扩增出外壳蛋白基因,并进行测序分析,证明该分离物归属于黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ。对45份辣（甜）椒材料进行室内苗期人工接种抗CMV鉴定,结果表明,4份辣椒材料对CMV表现为抗病,21份辣椒材料表现为中抗。结合农艺性状调查结果,筛选出5份抗CMV且农艺性状优良的辣椒材料。     

银杏类黄酮糖基转移酶基因全长序列克隆及表达分析

 以银杏（Ginkgo biloba L.）雄株叶片为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法,克隆到了类黄酮糖基转移酶（UDP-glycose：flavonoid glycosyltransferase,UFGT）基因GbUFGT的全长cDNA序列,其在GenBank中的注册号为JN640564.2。该基因编码区长1 491 bp,编码496个氨基酸。GbUFGT蛋白具有保守的PSPG基序、UDP–葡萄糖基转移酶和UDP–葡萄糖醛酸基转移酶结构域,与其他植物中的UFGT蛋白同源性较高。GbUFGT基因组序列与其cDNA序列相同,无内含子。半定量RT-PCR结果表明,GbUFGT在整个银杏叶片发育期均可较高水平的表达,且不同发育期表达水平无明显变化,属非发育时期特异性基因。     

羽衣甘蓝ARC1的基因分离、表达及与SRK相互作用的分析

 以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S_13-b S_13-b）为试验材料,利用RT-PCR的方法分离其ARC1基因cDNA序列（命名为BoARC1,GenBank登录号为EU344909）。BoARC1 cDNA序列中含有1个1 992 bp的开放读码框（ORF）,编码1个含有663个氨基酸的蛋白质。羽衣甘蓝BoARC1与油菜BnARC1的氨基酸序列具有94%的一致性;Southern杂交结果显示BoARC1在基因组中只存在单一拷贝;Northern杂交结果显示BoARC1特异性地在柱头组织中表达;在酵母双杂交试验分析中,BoARC1能够与SRK₃、SRK _13-b和SRK₉₁₀的胞内激酶域发生相互作用。     

桃成花基因PpLFY的克隆与表达及多克隆抗体制备

 以‘八月脆’桃成花诱导期腋芽为试材,克隆得到一个FLORICAULA/LEAFY同源基因,命名为PpLEAFY（PpLFY）,GenBank登录号为EF175869,该基因cDNA全长1 314 bp,ORF为1 248 bp,编码一个含416个氨基酸残基的蛋白,与其他物种中的LEAFY蛋白的同源性较高,为（74.22%~84.69%）。时期及组织特异性表达分析表明,PpLFY主要在叶片、花瓣及成花诱导期及花芽形态分化初期中表达。构建了pGEX-4T-1/PpLFY原核表达系统,获得了可溶性融合蛋白rPpLFY,分子量约为36 kD。利用该蛋白免疫新西兰大白兔,获得了抗rPpLFY的多克隆抗体,ELISA效价为1:10 000。     

津田芜菁BrEGL3 cDNA的克隆及表达分析

 EGL3（Enhancer of Glabra3）蛋白是一种bHLH类蛋白,是一类重要的转录调节因子。为阐释BrEGL3在‘津田’芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera‘Tsuda’）花青素生物合成中的调控作用,根据拟南芥EGL3基因序列信息设计兼并引物,克隆获得了‘津田’芜菁EGL3基因的全长cDNA序列,命名为BrEGL3,其GenBank登录号为HM208589。序列分析结果显示,BrEGL3全长1 794 bp,包含编码597个氨基酸的开放阅读框,分子量约为66.8 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白含有DNA结合域,该结合属于螺旋—环—螺旋家族。氨基酸对比分析表明,BrEGL3与萝卜EGL3蛋白相似性最高,其次为拟南芥中的EGL3。荧光定量PCR检测BrEGL3在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色芜菁根皮中表达量最高。     

菜薹花芽分化及BrcuFLC基因的克隆与表达

通过制作石蜡切片研究了菜薹(Brassica campestris L. ssp. chinensis (L.) Makino var. utilis Tsen et Lee)早熟品种‘油青49’和晚熟品种‘油青甜菜心80天’的花芽分化过程,结果表明,当展开2~3片真叶时花芽分化开始启动。用已报道的拟南芥Flowering locus C (FLC) 基因和FRIGIDA (FRI) 基因的保守区域设计引物,通过RT-PCR的方法从两个菜薹品种中均克隆得到了两个决定开花的关键基因,并命名为BrcuFLC (GenBank登录号为EF138603)和BrcuFRI (GenBank登录号为EU700362)。半定量式RT-PCR表达分析表明, BrcuFLC基因在早、晚熟菜薹品种的不同发育时期表达存在差异,表达量随真叶数增加而逐步减少,但在晚熟品种中BrcuFLC表达量降低幅度小;BrcuFRI则在早、晚熟品种的所有阶段表达都较低。BrcuFLC在菜薹不同部位表达的情况不同,在茎、叶中的表达强,花次之,根中表达较弱;而BrcuFRI在早、晚熟品种根中的表达量明显高于其它3个部位。