海南苦楝丛枝病植原体的分子鉴定

利用植原体16S rDNA通用引物对Rl6mF2/R16mR1,通过PCR技术从表现典型丛枝症状的苦楝植株总DNA扩增到约1.4 kb的特异片段,将此片段克隆后进行序列测定、分析及系统关系树构建.结果表明,该片段与16Sr I组中的各植原体同源率均达到99%以上,其中与16Sr I中的白蜡树丛枝(Ash witches'-broom,AWB,AY566302),柳叶菜变叶(Epilobium phyllody,EP,AY101386)和苦楝丛枝江西株系(Chinaberry witches'-broom,CWB-JX,AY859543)的同源率最高,达到100%,而与其它组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于97%.引起我国海南苦楝丛枝病的植原体应归属于16sr I组,将其暂命名苦楝丛枝植原体海南株系.     

黄化病槟榔园中8种植物植原体分子检测及其遗传变异分析

由植原体引起的槟榔黄化病是槟榔的一种毁灭性病害，明确发病槟榔园中植原体遗传多样性及其自然寄主种类，对于全面揭示该病害循环途径及流行规律具有重要意义。本研究对海南不同地区发病槟榔园中表现典型植原体病害症状的植物样品进行调查、采样，利用植原体通用引物进行扩增测序，揭示相关植原体株系的遗传变异规律与系统发育关系。结果表明：从6个山黄麻丛枝样品中扩增到植原体16S rRNA和secA基因片段，不同样品的2个基因序列均一致，从1个苦楝丛枝样品中扩增到16S rRNA基因片段。基于16S rRNA基因序列比对分析表明，山黄麻植原体与已报道山黄麻丛枝植原体序列相似性为100%，苦楝植原体与已报道苦楝丛枝植原体序列相似性为100%。系统发育分析表明：山黄麻丛枝植原体与16SrⅩⅩⅩⅡ组植原体株系聚于一个进化分支，苦楝丛枝植原体与16SrⅠ组植原体株系聚于一个进化分支；苦楝丛枝植原体与海南已报道槟榔黄化植原体16S rDNA序列相似性为100%。及时清理发病槟榔园中苦楝等植原体自然寄主，消除病源，切断植原体的传播途径，对于槟榔黄化病的有效防控至关重要。     

海南长春花变叶病病原物的分子鉴定

本研究分别利用植原体16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因的通用引物对自然表现变叶症状的海南长春花样品总DNA进行PCR扩增,获得16S rDNA基因片段长为1 432 bp,rp基因片段长为1 211 bp。BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明:海南长春花变叶病是由植原体引起的,该植原体株系属于16S rⅠ-B亚组,与候选种Ca.Phytoplasma asteris相关,将其暂命名为长春花变叶病植原体海南株系(Periwinkle phyllody strain Hainan,PP-Hn)。     

海南竹柏扁枝病病原植原体的分子检测鉴定

提取采自海南万宁热带植物园中表现典型扁枝症状的竹柏植株总DNA,利用植原体16S rRNA基因通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2进行巢式PCR检测。结果表明：扩增到大小约1.2 kb的植原体特异片段,通过对扩增片段进行克隆、测序和序列比对分析,结果确定为植原体感染。系统进化分析结果表明,该植原体（GenBank登录号：KP027298）为australasiae植原体候选种相关株系,与australasiae植原体候选种（GenBank 登录号：Y10097）的同源性为99.4％。进一步虚拟RFLP分析,结果表明该植原体属于花生丛枝植原体组（16Sr II）的一个新亚组,与其相似性最高的是16Sr II-A亚组（相似系数为0.97）。为指导竹柏扁枝病的防治奠定理论依据。     

海南长春花小叶病植原体16S rDNA基因片段的比较分析

从海南儋州地区的长春花上采集了表现小叶症状,疑似植原体感染的病样,利用植原体165 rDNA通用引物对R16mF2/R16mR1,应用PCR技术从该样品的总DNA提取物中扩增到预期大小的特异片段(约1.4kb),该片段的序列分析及系统关系树构建的结果表明,该片段与16Sr Ⅰ组中的植原体同源率均达到99%以上,而与其它组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于96%,与16Sr Ⅰ组植原体缬草黄化、翠菊黄化、桑萎缩和玉米丛矮等在同一条进化枝上.故初步认为引起海南长春花小叶病的植原体应归属于16Sr Ⅰ组,将其暂命名为长春花小叶植原体海南株系(Periwinkle little leaf phytoplasma strain Hainan,PLL-Hn).     

假臭草丛枝病植原体16SrDNA检测与PCR-RFLP分析

采用PCR技术对假臭草丛枝病原进行分子检测及巢式PCR扩增，得到1189bp的植原体16SrDNA片段，将该片段进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，并将与己知的植原体序列共同构建系统发育树，试图明确其与己知植物原体种类的关系，为进一步研究打下遗传基础。结果显示出所检测假臭草病株样品感染同种类型的植原体。直接PCR产物纯化后直接测序，序列显示出与16SrⅡ组植原体有较高的同源性，假臭草丛枝病与植原体16SrⅡ组中的花生丛枝病、番薯丛枝病和中国木豆丛枝病同源率最高，达到98．5％，因此可以认为假臭草丛枝病植原体属于16SrⅡ组，即花生丛枝病组（PnWB）。     

野茼蒿变叶病病原物的分子鉴定

利用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对海南表现变叶症状的野茼蒿样品总DNA进行PCR扩增,获得约1.4 kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhy Classifier分析表明,海南发生的野茼蒿变叶植原体在分类上属于花生丛枝植原体组中的A亚组,即16Sr II-A亚组。这是我国首次在野茼蒿上发现植原体病害。     

海南槟榔黄化病病原物的分子鉴定

槟榔黄化病是槟榔上的一种重要病害,如何快速检测该病原菌是防治该病的重要基础。利用植原体16SrDNA通用引物对海南感染黄化病的槟榔花苞总DNA进行巢式PCR扩增,获得约1.2kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明,引起海南槟榔黄化病病原植原体属于翠菊黄化植原体组(16SrⅠ组),且为该组中一个新的亚组,即G亚组,现将其暂命名槟榔黄化植原体(Arecanut yellow leaf phytoplasma,AYL)。     

海南槟榔黄化植原体分子检测及其系统发育关系研究

由植原体引起的槟榔黄化病是海南特色经济作物槟榔种植上的一种毁灭性病害。本研究通过PCR扩增测序、序列多重比对和系统发育分析,对海南部分代表性地区槟榔致死性病原植原体的序列信息与系统发育关系进行检测分析。结果表明：本研究检测的保亭、屯昌、万宁等海南部分代表性地区的槟榔黄化植原体的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA与16SrI组植原体同源性为100%。序列多重比对分析表明,本研究各槟榔黄化植原体株系与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝和日本洋葱黄化、美国翠菊黄化等植原体同源性为100%;与已报道的海南万宁、印度、海南三亚的槟榔黄化植原体16S rDNA序列同源性分别为99.9%、99.9%、99.8%。系统发育分析表明,本研究槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等株系聚于一个分枝,支持率为100%。此外,在发病槟榔叶片、花穗、心叶等组织部位均可检测到植原体。研究结果表明,海南槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等植原体株系的同源性极高,槟榔黄化病很可能会以这些寄主植物作为病原传播载体进行传播扩散。     

海南黄灯笼辣椒小叶病病原物的分子鉴定

采用分子生物学技术对田间疑似植原体侵染引起的小叶症状的黄灯笼辣椒样品进行检测,以明确其病原分类地位。利用植原体通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2,对上述黄灯笼辣椒叶片DNA进行巢式PCR扩增。结果表明:获得约1.2 kb的特异片段,经序列测定、Blast同源性检索及进化树和iPhyClassifier分析,获得该特异片段长为1 248 bp,与植原体16S rⅡ组中的花生丛枝植原体(L33765)同源性最高,达99%,聚类在同一个进化枝上,相似性系数为1.00,归属于16S rII-A亚组。暂将其命名为黄灯笼辣椒小叶植原体(Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma,CcJLL)。     

海南省槟榔病理性黄化发生分布情况及其植原体检测分析

槟榔是海南省重要的热带经济作物,受多种病害组成的槟榔病理性黄化的影响,尤其是槟榔黄化病,使槟榔产量造成严重损失。为明确当前海南省槟榔病理性黄化的发生分布情况及槟榔黄化病的危害情况,本研究对全省槟榔病理性黄化的发生分布进行调查,并对全省采集的槟榔黄化样品进行植原体检测分析。结果显示,当前海南省槟榔病理性黄化发生面积为38 300.04 hm²,占全省槟榔种植面积的33.27%,主要发生在海南东部、南部及中部市（县）,三亚市发生率最高,为77.48%,万宁市发生面积最大,为9734.66 hm²,西部市（县）的病理性黄化发生率均低于10%;当前海南省槟榔黄化病发生面积为32 102.38 hm²,占全省槟榔种植面积的27.89%,全省各市（县）均有槟榔黄化病发生,主要在海南中部和东部地区的发病率较高,琼海市、定安县、文昌市、屯昌县及琼中县的植原体检出率分别高达100%、100%、100%、98%、95.38%,除临高县、白沙县及东方市外,其余市（县）检出率均高于50%,万宁市槟榔黄化病发生面积最大,为7909.41 hm²,其次为琼海市;每个市（县）槟榔植原体在各树体间的含量分布差异较大,定安县植原体的平均含量最高,为1443.36 copies/μL,向周边市（县）递减,除了在海南东北部市（县）的槟榔植原体含量较高外,其他市（县）植原体含量较低。以上研究表明,当前海南槟榔病理性黄化发生严重,植原体是造成海南省槟榔病理性黄化的主要病原之一。     

海南长春花黄化病植原体的DAPI荧光显微检测

对感染黄化病的海南长春花植株，应用DAPI荧光显微技术对其嫩茎和叶柄进行了切片染色观察，结果表明：在感病植株的韧皮部筛管分子中存在大量特异性的植原体DNA荧光光点，而在健康植株的筛管分子则未发现有特异性的植原体荧光。另对其茎和叶柄中的植原体含量进行比较，结果显示茎中的含量要比叶柄中稍高。     

Devastation of sesame (Sesamum indicum L.) crops in different agroclimatic zones of India by genetically diverse subgroups of phytoplasma

The sesame crop is highly susceptible to infection by phytoplasmas, a class of cell wall-less plant pathogenic bacteria (Mollicutes), which is responsible for widespread loss of sesame crops in both North and South India in recent years. Therefore, characterizing the pathogen population is required before the control measures can be devised and implemented. With molecular tools based on nested polymerase chain reaction (PCR) assays, sequencing, restriction profiling, and phylogenetic analysis, phyllody-affected sesame plants collected from nine different states of India were found to be infected by phytoplasmas belonging to two 16Sr groups, namely 16SrI and II. Two subgroups of phytoplasma −16SrI-B and 16SrII-D— were prevalent in symptomatic sesame samples collected from North India, whereas phytoplasma of only the 16SrII group was found in South India. However, the latter samples were diverse, belonging to three different subgroups (16SrII-A, II-C, and II-D). In addition, yearly phyllody-affected sesame samples from Delhi for 4 consecutive years (2007–2010) showed variation in the infecting phytoplasma: the subgroup 16SrII-D was detected in samples collected in 2007, and 16SrI-B was predominantly found in the samples collected in the subsequent years. The study also provides molecular evidence for the association between 16SrI-B phytoplasma and different symptoms in sesame crops such as fasciation, little leaf, and stunting. This is the first study to report the association of the phytoplasma subgroups 16SrII-A and II-D with sesame crops in India. This study provides a baseline for designing specific detection and molecular analysis strategies for quarantine purposes. It also highlights the need for examining the dynamics of seasonal or location-specific variation in vector populations to determine the pattern of infection outbreaks.     

海南农垦橡胶树叶片氮磷钾含量年际变化分析

对15 a来海南农垦橡胶树叶片氮磷钾养分含量年际变化进行分析,发现在所采集的叶片样本中氮素养分含量整体偏低,约有50%的样本低于正常指标值下限;磷素养分含量大部分属于正常指标范围内,但近两年有下降的趋势;钾素养分含量虽然大部分超过正常指标值上限,但仍未达到丰产指标值。研究结果表明,氮素仍是海南农垦橡胶树正常生长的主要养分限制因子,目前的海南农垦橡胶树钾素营养诊断指标有偏低的现象。     

长春花小叶病植原体质粒DNA克隆及其分子特征

为了测定长春花小叶病植原体质粒及分析其分子特征,扩增长春花小叶病植原体质粒片段,然后进行反向扩增,拼接得到质粒全序列,且预测质粒编码蛋白的跨膜区、亚细胞定位等。结果表明,获得的质粒全长为4 102 bp,A+T含量为75.18％,编码5个蛋白,且将该质粒命名为pPLLHn-1。其中ORF的2、3、4编码蛋白分别含有2、1、2个跨膜区,ORF3的信号肽（Singnal peptide,SP）的信号值为0.948,ORF3编码的氨基酸序列与洋葱黄化植原体质粒EcOYW1参与质粒拷贝数控制的蛋白（Copy number control protein）具有97％的同源性。此结果说明长春花小叶病植原体质粒pPLLHn-1编码的5个蛋白中,除与质粒复制有关的RepA和SSB外,另外3个均为跨膜蛋白,根据分泌蛋白的特征分析初步推断ORF3蛋白为分泌蛋白。