公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达(摘要)(英文)

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达。[方法]根据苜蓿抗寒基因(CAS19)核酸序列设计1对引物,用RT-PCR扩增出分离CAS19的蛋白基因,并克隆到pMD18-T Vector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒PBCAS。经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗。[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达。[结论]该研究为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

拟南芥抗寒基因ICE1的克隆及功能分析

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进化树表明,拟南芥ICE1基因与其他物种的ICE1基因差别较大。用农杆菌介导法得到4株阳性烟草植株,Southern blotting检测证明,ICE1基因已经以单拷贝的形式整合到烟草基因组中。实时荧光定量PCR检测表明,ICE1基因在转基因烟草植株的根、茎和叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量最高。4℃低温环境下,与未转化植株相比,转ICE1基因烟草植株叶片的相对电导率降低了12.00%~17.65%,脯氨酸含量增加了13.28%~24.10%,丙二醛含量减少了7.09%~14.52%,过氧化物酶活性提高了9.39%~22.54%。【结论】克隆获得了拟南芥ICE1基因的完整开放阅读框序列,在烟草中转入ICE1基因可提高其耐寒性。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

棉花热激转录因子GhHsf基因的表达及其烟草转化

[目的]了解棉花GhHsf基因的功能,分析该基因的表达模式,构建其植物表达载体并转化烟草获得转基因植株.[方法]利用半定量RT-PCR对棉花热激转录因子基因GhHsf的表达模式进行分析.构建pCAMBIA1301-GhHsf植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,并进行鉴定.[结果]棉花GhHsf基因在棉花各组织中为组成型表达;构建GhHsf基因植物表达载体pCAMBIA1301-GhHsf,转化烟草获得了转基因植株.[结论l棉花Gf基因在棉花的不同组织中是组成型表达,获得了转GhHsf基因烟草株,为进一步开展功能研究奠定基础.     

GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达研究

[目的]对GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达进行研究。[方法]分别克隆IPT基因及GmSARK基因启动子,构建它们的植物表达载体并进行拟南芥的转化,利用PPT(phosphinothricin)除草剂筛选,检测T1代转基因植株;对T1代转基因植株进行黑暗避光和干旱处理后进行半定量RT-PCR分析。[结果]成功克隆得到了IPT基因及GmSARK基因,并构建了它们的p3301-GmSARK-IPT植物表达载体;对T1代转基因植株的RT-PCR表明,目的基因mRNA水平上有所表达。[结论]为进一步研究GmSARK启动子驱动的IPT基因在抗逆中的作用奠定了基础。     

小黑杨PsneIF5A2/4基因植物表达载体的构建及在烟草中的转化研究

[目的]研究杨树eIF5A基因的功能,为林木抗性育种研究提供参考。[方法]构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树eIF5A基因已经整合入烟草基因组中,且转基因烟草比野生型烟草叶片抗重金属能力提高。[结论]杨树eIF5A基因能促进转基因烟草的抗胁迫能力,为林木抗逆育种机理奠定了理论基础。     

NtMYC1a转录因子的克隆与功能初步分析

从烟草根系中克隆NtMYC1a基因,构建表达载体并在烟草中瞬时表达,探讨了NtMYC1a转录因子在烟碱生物合成中的作用。转基因烟草中的NtMYC1a表达显著升高,表明成功构建了NtMYC1a表达载体并转化了烟草;转基因烟草中的PMT表达量显著升高,表明NtMYC1a能够正调控烟碱的合成;茉莉酸与干旱处理烟草后,检测到NtMYC1a和PMT的表达量显著升高,表明在茉莉酸、干旱促进烟碱合成的生物学过程中,NtMYC1a具有正调控的功能。     

质粒pUC19-CM-D的构建及应用

[目的]用克隆载体pUC19构建乳杆菌自杀质粒及乳杆菌基因缺失工程菌[方法]在质粒pUC19的多克隆位点插入氯霉素抗性基因构建pUC19-CM载体;在pUC19-CM载体氯霉素抗性基因的两侧均添加1个用于同源重组的同源臂,再构建成自杀质粒pUC19-CM-D。将自杀质粒pUC19-CM-D转化乳杆菌进行抗性筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。[结论]pUC19-CM-D质粒的构建及应用为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供了一个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定了基础。     

抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建及烟草的转化

[目的]构建抗黄瓜花叶病毒RNAi载体,并将载体转入烟草。[方法]采用RT-PCR方法,扩增黄瓜花叶病毒NS04加工番茄分离物的RNA2基因组的序列。选取CMVRAN2基因组中的复制酶片段作为靶序列,构建pBi35SCR2真核表达载体,并对表达载体进行鉴定;通过农杆菌介导的方法将表达载体转入烟草,用PCR的方法检测载体是否转入。[结果]系统进化树分析结果表明,RNA2中编码CMV-2a的序列与中国浙江的DQ412731分离物有较高核苷酸及氨基酸同源性,分别达到98.0%和96.5%;PCR结果表明,试验成功构建了pBi35SCR2真核表达载体,并成功将表达载体转入烟草。[结论]试验获得的转基因烟草可作为后期攻毒试验的材料,并为研究加工番茄抗黄瓜花叶病毒奠定了基础。     

HbDREB1基因表达载体的构建及其转基因烟草的鉴定

[目的]研究强抗寒性牧草——短芒大麦DREB1（dehydration responsive element binding protein1）基因的功能,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。[方法]利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,对转基因烟草进行分子生物学鉴定,并对离子渗漏率、脯氨酸表达量生理生化特性进行测定。[结果]HbDREB1整合入烟草基因组,已在转录水平上表达,转基因烟草在冷胁迫条件下的离子渗漏率明显低于对照组,且其脯氨酸表达量明显增高。[结论]HbDREB1基因具有提高植物抗寒性的潜能。     

大麦黄矮病毒运动蛋白在烟草中的瞬时表达(摘要)(英文)

[目的]快速鉴定运动蛋白基因在烟草中的瞬时表达,进一步研究该外源基因的功能。[方法]将大麦黄矮病毒的运动蛋白基因定向克隆到马铃薯X病毒载体上,得到重组的马铃薯X病毒,电击转化农杆菌后,利用农杆菌渗透注射技术注射到本生烟草的叶片中,逐日跟踪观察病毒对烟草的侵染状况。[结果]重组的PVX病毒载体进行PCR鉴定和双酶切鉴定(BamHI+XhoI),均得到了462bp的基因片段,证明外源片段BYDV-MP确实克隆到了PVX病毒载体GR107上。将含有重组的PVX病毒载体GR107-MP和空的PVX病毒载体GR107的农杆菌渗透缓冲液注射到5～6叶期的烟草幼苗后,第7天观察,重组病毒载体侵染的烟草系统叶有病毒侵染症状,而对照组未有此现象。对2组实验进行逐日跟踪观察,重组病毒载体侵染的烟草有较严重的病毒侵染症状和叶片卷曲现象,后期引起注射叶及系统叶坏死。而空病毒载体侵染的烟草只有轻微的病毒侵染症状,并能够恢复健康。对侵染的烟草进行RT-PCR检测,结果表明外源基因BYDV-MP在烟草体内进行了正常的转录和表达。[结论]BYDV-MP蛋白促进了PVX的系统侵染速度,加重了系统侵染的病毒症状,是病毒病症的决定因子;利用PVX表达载体表达异源MP的方法是可行的。     

烟草H2A的序列分析、原核表达载体构建及诱导表达

[目的]对H2A进行序列分析及蛋白结构域分析,并将其克隆入p GEX4T-1原核表达载体进行诱导表达。[方法]以p GADT7-Rec-H2A质粒为模板,通过PCR扩增烟草H2A(3~140 Aa),将其插入原核表达载体p GEX-4T-1中,并将重组载体转入BL21(DE3)中,诱导其表达。[结果]构建了烟草H2A基因全长和p GEX4T-1载体大片段连接的融合表达载体,并成功地诱导其表达。[结论]该研究为运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作进而确定Nt Tkr与蛋白互作的关键结构域奠定了试验基础。     

大麦黄矮病毒运动蛋白在烟草中的瞬时表达

[目的]快速鉴定运动蛋白基因在烟草中的瞬时表达,进一步研究该外源基因的功能。[方法]将大麦黄矮病毒的运动蛋白基因定向克隆到马铃薯X病毒载体上,得到重组的马铃薯X病毒,电击转化农杆菌后,利用农杆菌渗透注射技术注射到本生烟草的叶片中,观察病毒对烟草的侵染状况。[结果]渗透注射后第7天观察,重组病毒载体侵染的烟草系统叶有病毒侵染症状,而对照组未有此现象。对2组试验进行逐日跟踪观察,重组病毒载体侵染的烟草有较严重的病毒侵染症状和叶片卷曲现象,后期引起注射叶及系统叶坏死。而空病毒载体侵染的烟草只有轻微的病毒侵染症状,并能够恢复健康。对侵染的烟草进行RT-PCR检测,结果表明外源基因BYDV-MP在烟草体内进行了正常的转录和表达。[结论]BYDV-MP蛋白促进了PVX的系统侵染速度,加重了系统侵染的病毒症状,是病毒病症的决定因子;利用PVX表达载体表达异源MP的方法是可行的。     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

水稻硫转运蛋白基因OsST的亚细胞定位

[目的]构建水稻硫酸根转运基因OsST与YFP黄色荧光蛋白融合表达载体,对OsST蛋白进行亚细胞定位。[方法]从水稻叶片的cDNA中克隆OsST基因ORF全长,测序验证后连入pAT—YFP表达载体,通过基因枪将融合栽体转入洋葱上表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中荧光发光部位。[结果]OsST蛋白定位于细胞膜和核膜上。[结论]为进一步研究硫转运蛋白的功能及硫酸根运输的机理奠定了基础。