猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白型的研究

对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）12个血清的外膜蛋白型进行了测定。用N-十二烷酰肌氨酸法提取其主要外膜蛋白（OMPs）,经SDS-PAGE电泳后,用考马斯亮兰法进行染色,结果APP 12个血清型的OMP可以分为6个OMP型,表明APP的OMP具有多样性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的原核表达

经PCR从含有OML基因片段的重组质粒App-OML-1中扩增出mAppOML-1基因,同时对目的基因和表达载体pPRoEX HTb进行酶切、连接、转入E.coliBL21,构建重组质粒pPRoAppOML-1.阳性克隆用IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的融合蛋白分子质量约为45 ku,Western-blotting分析表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性.     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR分群研究

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropnemonia,PCP)是猪的一种以急性出血性和慢性纤维素性的胸膜肺炎病变为特征的呼吸道传染病[1].该病是影响世界集约化养猪场健康发展的三大呼吸道传染病之一.其病原体为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP),可分为2个生物型,即生物Ⅰ型和生物Ⅱ型.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

从江西省猪场病死猪肺脏中分离到三株胸膜肺炎放线杆菌。本试验对分离菌株的理化特性进行了测定，并用分离菌株制备了灭活疫苗，有效控制了菌株分离场的猪传染性接触性胸膜肺炎。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

从陕西某养猪场表现呼吸困难、下痢及肺炎病变的３月龄病猪检出弓形虫滋养体并分离到一致病菌。该菌表现出形态多样性、革兰氏染色不定和形成从琼脂表面难以移取的菌落等特点，小鼠试验显示有毒力。药敏试验表明，该菌对痢特灵、氯霉素高度敏感。系统的生物学特性鉴定表明，该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。     

胸膜肺炎放线杆菌毒力因子重组蛋白免疫原性研究

【目的】研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)重组亚单位疫苗的免疫保护效果。【方法】用1.0mmol/LIPTG诱导重组表达质粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1,SDS-PAGE鉴定。纯化的表达产物通过Western blot分析有较好的免疫原性。将rApxⅠ、rApxⅢ和rOmp组合作为疫苗Ⅰ组,rApxⅠ、rApxⅢ、rOmp和灭活菌苗组合作为疫苗Ⅱ组,APP 1、3、7型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBSⅣ作为空白对照组,进行家兔的免疫试验。免疫共分2次,每次间隔2周。【结果】疫苗Ⅱ组的抗体水平均显著高于疫苗Ⅲ组,疫苗Ⅰ组抗体水平不如疫苗Ⅲ组,其血清效价最高滴度为1∶256。【结论】猪传染性胸膜肺炎毒力因子重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究新型亚单位疫苗奠定了基础。     

猪放线杆菌性胸膜肺炎的诊治

猪放线杆菌性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种伴有胸膜炎的出血性坏死肺炎．可发生于仟何年龄的猪只，呈世界性分布。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究

将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMcaCl<,2>的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化Apx Ⅰ.将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察.将纯化的Apx Ⅰ与弗氏佐剂按1:1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量.根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒.结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2～103.5mg/kg;Apx Ⅰ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果.     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因（0MP-1）的克隆、表达及其ELISA方法的建立

猪传染性胸膜肺炎由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起,是猪最重要的呼吸道传染病之一。通过筛选APP3～8kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到其DNA序列,通过BLAST分析确定此片段为APP外膜蛋白基因,预计成熟蛋白质的分子量为48．766kD。根据序列设计特异性引物,用PCR扩增该基因,分子克隆表达该外膜蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应。纯化该重组蛋白,并将其作为抗原包被ELISA酶标板,对已知阳性血清、阴性血清和临床送检血清样品进行ELISA检测,为最终建立APPELISA检测方法奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌基因组文库的构建

由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的猪传染性胸膜肺炎是猪最重要的呼吸道传染病之一。为研究该细菌表面蛋白的结构与功能,选取APP代表菌株,提取其基因组DNA,用TSPS091随机消化成3～8kb的片段并回收,连接到预先消化的入ZAPⅡ载体上,经过包装、扩增和滴定后,成功地构建了APP基因组文库。     

不同血清型禽大肠杆菌外膜蛋白免疫原性研究

用提纯的O_2、O_(18)、O_(46)、O_(76)禽大肠杆菌外膜蛋白对10日龄小鸡进行免疫,ELISA检测显示抗体水平显著上升;经同型菌株和异型菌株攻毒,结果O_(46)菌株外膜蛋白免疫组用同型菌株攻毒的病变率与对照组相比差异显著(P<0.05),其余组均差异不显著,但各免疫组病变率均比对照组低。说明用禽源大肠杆菌外膜蛋白免疫,无论对同型或异型菌株的攻击,都使机体受到一定的保护作用。     

副溶血性弧菌外膜蛋白的提取与免疫鉴定

[目的]为进一步确定致病性副溶弧菌共有的特异性抗原和保护性抗原奠定基础。[方法]通过小鼠毒力试验研究5株副溶血性弧菌菌株对小鼠的致病性,比较在不同培养基和培养时间下所提取的外膜蛋白的SDS-PAGE图谱并通过Western blotting分析研究副溶血性弧菌菌株的免疫原性。[结果]5株临床分离的副溶血性弧菌菌株明显对小鼠具有不同的致病性,同时能在兔血平板上形成明显的溶血圈,为TDH阳性菌株。通过菌体免疫获得的多克隆抗体,与除副溶血性弧菌外的其他试验菌株均无交叉反应。Western blotting分析显示该多克隆抗体与5株致病性副溶血弧菌菌株可发生程度不等的阳性反应,提取的外膜蛋白具有较好的免疫原性。[结论]该研究为制备有效预防副溶血性弧菌引起的疾病的菌苗提供了理论基础。     

临床分离鸡源性大肠杆菌外膜蛋白型的研究

[目的]了解禽致病性大肠杆菌分离株的遗传相关性。[方法]对分离自保定、秦皇岛和北京3个地区规模化养鸡场的病死鸡体内的38株大肠杆菌,采用超声波裂解和N-十二烷基肌胺酸钠进行外膜蛋白(Omp)提取,利用SDS-PAGE进行Omp分型。[结果]38株大肠杆菌共有3个Omp型,其中Omp-1型为O78、O88、O2、O18、O93、O766个血清型分离株所共有,Omp-Ⅱ型多为O76血清型分离株,Omp-Ⅲ型为O93、O78、O88、O2分离株所共有。这表明同一血清型的菌株可能属于完全不同的Omp型,而血清学上毫不相关的分离株之间却可具有相同的Omp型。[结论]该研究证实了同一血清型的分离株之间可发生遗传分化,而不同血清型的分离株之间也可具有不同程度的遗传相关性。     

鸭疫里默氏杆菌中国分离株的外膜蛋白A基因的克隆与序列分析

为了对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)中国分离株的外膜蛋白A(OmpA)基因的序列进行分析,根据GenBank中已发表的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的外膜蛋白A(Om-pA)基因序列,在其高度保守区设计一对特异性引物,应用PCR技术,分别扩增从中国广东、福建和山东等地分离的8株鸭疫里默氏杆菌中国分离株的OmpA基因,克隆测序后与GenBank中已发表的26株鸭疫里默氏杆菌进行序列比较,结果表明:所有菌株的OmpA基因均为由1164个碱基组成的ORF,编码387个氨基酸组成的蛋白质,起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA,其核苷酸序列非常保守,同源性高达88.2%~100%,氨基酸同源性达到88.9%~100%。试验表明,OmpA基因具有种内相对保守性,其核苷酸与氨基酸同源性与鸭疫里默氏杆菌的血清型、分离时间和地点之间无必然联系。     

沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡免疫保护效果的研究

探究鼠伤寒沙门氏菌(ST)胞外囊泡(OMVs)对肉仔鸡的免疫保护效果。350只1日龄健康爱拔益加雏鸡常规条件下饲养至7日龄,选择沙门氏菌感染为阴性、健康及体质量差异不显著的雏鸡320只随机等分为5组,每组8重复,每重复8只。试验设计为未感染的对照组(PBS组)、沙门氏杆菌感染组(ST组,攻毒试验用)和3个不同OMVs免疫剂量免疫组,分别注射5、10和20μg/(d·只)的OMVs(OMV5、OMV10和OMV20)。从8日龄开始,每隔1周对OMVs免疫组分别腹腔注射对应剂量的OMVs,每次连续3d,共免疫3次;PBS组和ST组分别注射等量PBS溶液。试验鸡30日龄时,对ST组和3个OMVs免疫组腹腔注射1×109 CFU的ST进行攻毒,PBS组注射等量PBS溶液,饲养观察5d。结果表明:1)在8～28日龄的免疫期,与PBS组相比,OMV5和OMV10组的试验鸡日均采食量、平均日增量和饲料转化率均无显著差异,而OMV20组的试验鸡日均采食量和平均日增量显著降低、饲料转化率显著增加;3个OMVs免疫组的死亡率及免疫器官指数与PBS组均无显著差异;2)3个OMVs免疫组试验鸡的免疫器官指数与PBS组无显著差异;OMVs免疫可显著提高免疫期间血清中的溶菌酶活力、白蛋白和C3质量浓度及SOD活力;3)与ST组相比,OMVs免疫组在ST攻毒后显著消除ST感染引起的试验鸡体质量下降,显著提高ST感染鸡的存活率,尤以OMV10和OMV20免疫组效果最好。此外,10μg/(d·只)的OMVs免疫可显著降低ST感染后血液中的IL-1β和TNFα的质量浓度,且有降低IL-6质量浓度的趋势。由此可知,适量剂量的OMVs免疫对肉仔鸡生产性能无显著影响,但可增强肉仔鸡机体免疫功能,且具有显著提高肉仔鸡抗ST感染的能力,本试验中ST-OMVs最佳免疫剂量为10μg/(d·只)。     

斑点叉尾鮰对3种致病菌外膜蛋白(OMP)的免疫应答

利用从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)中提取的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)作为免疫原,注射接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用A. hydrophila活菌攻毒方法,比较了3种致病菌OMP对斑点叉尾鮰的免疫原性。试验结果表明:从3种致病菌中提取的OMP对斑点叉尾鮰均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A. hydrophila活菌攻毒的相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)明显上升。说明在3种供试菌的OMP上不同程度地存在共同保护性抗原。     

猪源嗜性衣原体HB1043株主要外膜蛋白(MOMP)基因的分析及重组表达

根据GenBank中衣原体主要外膜蛋白(MOMP)全基因序列设计特异性引物,以临床分离的衣原体病原中提取的衣原体全基因组为模板,利用特异性引物PCR扩增得到MOMP全基因序列.通过BLAST比对,结果显示其与已提交的猪流产衣原体CG1株的MOMP序列(EU531729)有1个碱基不同.根据对测序结果进行信号肽序列预测及内切酶位点分析,选用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切将目的蛋白序列克隆到表达载体pET-28a上,得到重组质粒pET-28a-MOMP.将重组质粒转化入E coli BL21进行表达,表达产物使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到目的蛋白rMOMP.目的蛋白经Western-blot检测,证明其具有免疫学活性.     

创伤弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆与表达

创伤弧菌是导致鳗鲡产生体表溃疡死亡的重要致病菌。本研究克隆了创伤弧菌FJ03-X2株外膜蛋白基因(ompU),构建含该基因的原核表达载体,命名为pET-32a-ompU,将其转化到大肠杆菌E.coli中进行融合表达。37℃,0.5mmol.L-1的IPTG诱导4h,融合蛋白rompU以可溶形式表达,采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白,SDS-PAGE显示纯化后的rompU为与预期大小一致的单一条带。将纯化的rompU免疫SD级大鼠,ELISA检测收获的多克隆抗体血清效价,并通过Western-blot证实该OmpU多克隆抗体可以识别创伤弧菌FJ03-X2株中的天然外膜蛋白OmpU。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的最重要呼吸道传染病之一。通过筛选APP 3～8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为APP Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子量为45.716 KD。根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应;研究还发现,纯化的Ⅱ型分泌蛋白能结合C3。