SYBR Green I实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明：应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2（±0.5）。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。     

SYBR~ Green I实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。     

SYBR(R) Green Ⅰ实时荧光PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR(R)Green Ⅰ实时PCR方法.同时针对油菜FatA基因设计出内源基因.结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR(R)Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5).SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法.     

SYBR Green Ⅰ实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物，应用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明，应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过溶解曲线确定其熔点值为（80．2±0．5）℃，而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR~ GreenI实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系。结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法。     

SYBR(R)Green I实时PCR鉴定检测转基因油菜RT73品系

利用特殊性引物,应用SYBR(R) Green I实时PCR技术鉴定检测了商业化种植的转基因油菜RT73品系.结果表明,应用实时PCR技术,利用SYBR(R) Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为(80.2±0.5)℃,而对其他油菜品系则检测不到荧光信号.SYBR(R) Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分了特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是基因鉴定检测的新方法.     

转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光定量PCR检测方法建立

[目的]为完善我国转基因检测方法体系,建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, PCR)检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针,建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法,并测定该方法的灵敏度、特异性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示,其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好,灵敏度高,有良好的可重复性,适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。     

四种转基因玉米新型质粒标准分子协同实验验证

构建了分别适于转基因玉米GA21、TC1507、T25和Bt11品系特异性双重PCR检测标准分子,并对其在定性PCR检测体系中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对7家实验室返回结果的统计分析表明,标准分子pBt11、pTC、pT25和pGA分别对转基因玉米Bt11、TC1507、T25和GA21品系具有高特异性。4个标准分子在zSSⅡb和对应品系特异性序列单一PCR检测体系中检测下限均为50拷贝。因此,4个标准分子均可作为新型标准物质用于相应转基因玉米品系特异性定性检测。     

口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系定量PCR检测方法

以我国口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系为研究对象,根据其外源插入片段与基因组DNA3'端邻接区序列设计引物和探针,经筛选和优化后,建立了转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。对方法的适用性测试结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法高度特异于转基因棉花T304-40品系检测,反应效率达94.2%,绝对灵敏度为20拷贝基因组DNA,定量下限为25拷贝基因组DNA。以研制的检测方法建立标准曲线对盲样进行定量分析,结果表明4个盲样的测定值与设定值间的偏差均小于10%。因此,本研究建立的转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可准确地对棉花及其制品中转基因棉花T304-40成分进行定性或定量检测分析。     

四重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45

【目的】建立多重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45的方法,为其转基因检测提供技术支持。【方法】选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR检测基因,特异性引物序列参照国家相关标准或文献,通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化、灵敏度测试及已知样品验证,建立抗除草剂转基因油菜T45多重PCR检测体系。【结果】多重PCR的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2,方法灵敏度为0.01 ng/μL,所有已知样品的扩增条带与其分子特征显示的外源基因元件完全一致。【结论】建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分,为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。     

利用复合PCR结合DNA芯片的方法进行快速转基因事件检测

以我国批准进口用作加工原料的6种转基因玉米为材料,根据其外源基因、载体构建及插入位点,应用6对特异性引物及35S、NOS引物,设计并优化了复合PCR反应体系,对其进行转基因成分检测.同时尝试利用复合PCR与DNA芯片相结合,对不同转基因玉米混合样品进行检测,探索建立转基因事件快速检测和确认方法.     

转基因油菜筛查阳性质粒分子的研制及应用

【目的】 转基因油菜是四大转基因作物之一,是中国转基因生物安全监管的重要对象,转基因检测为转基因安全监管提供技术支撑。转基因筛查是转基因检测的第一步,筛查靶标设置不合理会导致漏检部分转基因成分。建立转基因油菜筛查策略,并研制与筛查策略配套的阳性质粒分子,将为中国的转基因油菜安全监管提供强有力的技术支撑。【方法】 通过收集数据库中登记的转基因油菜品种的外源基因元件信息,分析转基因油菜品种中常用的调控元件和标记基因,基于最大筛查覆盖率原则,确定转基因油菜的筛查靶标。通过检索数据库或查询专利,收集筛查元件的核苷酸序列。一个筛查元件通常有多个标准方法,查阅各筛查元件的检测标准,分析各标准中普通PCR引物对和实时荧光PCR引物/探针组合在筛查元件核苷酸序列中的位置,根据引物探针的结合位点,确定拟构建到质粒上的各筛查元件的核苷酸序列。人工合成各筛查元件和油菜内标基因的融合序列,克隆到常用质粒pUC18,构建阳性质粒分子。采用各筛查元件的普通PCR和实时荧光PCR方法,评估阳性质粒分子的适用性。【结果】 建立了转基因油菜的筛查策略,通过检测CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、Bar、PAT、CP4-EPSPS、NPTⅡ、HPT、NOS终止子和PinⅡ终止子共9个基因元件,可实现已知信息转基因油菜品种的全覆盖。构建出聚合9个筛查元件和2个油菜内标基因HMG I/Y和CruA的转基因油菜筛查质粒分子pYCSC-1905。9个筛查元件和2个油菜内标基因的扩增效率均在90%—110%,证明质粒分子上的不同靶标序列没有相互干扰,影响PCR的扩增效率。质粒分子pYCSC-1905可用作9个筛查元件和2个油菜内标基因的通用阳性对照,适用于国家标准（GB/T和农业农村部公告）、出入境检验检疫行业标准（SN/T）和欧盟标准。【结论】 提出的转基因油菜筛查策略涵盖9个基因元件,可实现从商业化到安全评价各阶段转基因油菜的筛查检测,显著降低转基因油菜的筛查漏检率。研制的配套质粒分子pYCSC-1905为转基因油菜筛查和各基因元件标准方法的应用提供了通用标准样品,保证检测机构间检测数据的准确性和可比性。     

单头灰飞虱体内两种水稻病毒的双重一步法RT PCR检测

灰飞虱传播的水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)是危害我国水稻生产最主要的2种病毒,建立灰飞虱体内RSV和RBSDV快速、可靠的检测方法是水稻生产中的重要问题。本研究根据RSV RNA3和RBSDV S10序列分别设计了2个病毒的特异性引物,通过退火温度和PCR循环数等条件的优化,建立了灰飞虱体内RSV和RBSDV快速鉴定的双重一步法RT PCR体系。对一步法和两步法RT PCR检测结果进行比较,表明2种方法均能准确有效鉴定灰飞虱体内的2种病毒,且两步法的检测效果略好于一步法。而灵敏度实验表明一步法RT PCR可以从0005 ng·μL-1的灰飞虱RNA初始模板中准确检测到病毒,完全满足单头灰飞虱体内病毒检测的需要。应用本研究建立的双重一步法RT PCR体系对200头获毒灰飞虱样品中的RSV和RBSDV进行了检测,结果进一步证实了此方法的稳定性和可靠性。     

山东省禽源致病性大肠杆菌质粒介导喹诺酮类药物耐药基因的检测

为了解山东省禽源致病性大肠杆菌质粒介导喹诺酮类药物耐药基因分布情况,对2004～2011年间分离的230株禽源致病性大肠杆菌进行了qnrA、qnrB、qnrS基因的PCR检测,结果发现未检出qnrA和qnrB,qnrS基因的检出率为25.22%(58/230)。对部分检出的qnrS基因测序后发现假阳性率较高(8/24),为了提高检测的特异性,建立了检测qnrS基因的套式PCR,测序结果表明该方法检出准确率为100%,使用该方法检出230株细菌中qnrS基因的携带率为16.52%(38/230),表明含qnrS基因的耐药质粒在山东省禽源致病性大肠杆菌中分布较为广泛。     

一种豇豆重花叶病毒IC-RT real-time PCR检测方法的建立

为建立豇豆重花叶病毒(Cowpeasevere mosaic virus,CPSMV)免疫捕获-反转录-实时荧光(IC-RTreal-time)PCR分子检测方法,利用从ATCC和DSMZ引进的CPSMV标准毒株,先建立CPSMVRTreal-time PCR检测方法;在此基础上,建立用于CPSMV检测的IC-RTreal-time PCR方法.结果表明:IC-RTreal-time PCR方法的灵敏度可达500 pg叶组织;该方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便等优点,省去了RNA的提取过程,适用于豇豆等豆类种子及种苗中对豇豆重花叶病毒的快速检测.     

油菜中转基因成分的筛查检测策略

旨在建立油菜中转基因成分的快速筛查方法,服务于农业转基因生物安全监管。根据转基因油菜常用转化遗传元件信息建立转基因油菜的筛查策略,并使用定性PCR法检测。结果表明,利用CaMV35S启动子、NOS终止子、bar基因、pat基因、CP4-epsps基因和NPT II基因6个靶标元件的组合,理论上可筛查92%的已知商业化转基因油菜转化事件。该方法的检测灵敏度达到1g/kg,可对油菜中的大多数转化事件进行快速、高灵敏度的筛查。     

血管内皮生长因子（VEGF）实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

 应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18 T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103~1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92％)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品,为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。     

利用实时荧光PCR快速筛查玉米中转基因成分

玉米是拥有转基因转化体数量最多的作物,多样的转化体增加了玉米中转基因成分筛查的难度。为了建立玉米中转基因成分的快速筛查方法,利用Taqman探针实时荧光PCR方法,通过对玉米样品中CaMV35S启动子(P-35S)和NOS终止子(T-NOS)2个元件组合的检测,完成对现有玉米转化体的筛查。建立的Taqman探针实时荧光PCR方法灵敏度可达到0.1%,检测时间较普通PCR方法缩短1h以上。同时提出了转基因玉米转化体鉴定路线图。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

猪白细胞介素-8荧光定量PCR检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出猪白介素（IL）-8基因的278 bp cDNA片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有猪IL-8 cDNA片段的重组质粒。通过质粒的Real-time PCR方法,建立猪IL-8 cD-NA的Real-time PCR标准曲线。该方法特异性强、灵敏度高、重复性强,可用于猪IL-8 mRNA含量的定量检测。