光照强度对三疣梭子蟹呼吸代谢的影响

在实验室条件下,研究了光照强度(0,200,800,1 500,3 500 lx)对三疣梭子蟹耗氧率、排氨率、肌肉中乳酸含量、血淋巴能源物质及己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和乳酸脱氢酶(LDH)4种呼吸代谢酶活力的影响。结果发现,5种光照强度下,三疣梭子蟹的耗氧率和排氨率均有显著差异,200~1 500 lx下,蟹的耗氧率显著高于0和3 500 lx处理组(P0.05);1 500 lx下,蟹的排氨率显著低于其他处理组(P0.05);光照强度对三疣梭子蟹血淋巴中的总蛋白含量产生显著影响(P0.05),但对氧氮比和血淋巴中的其他能源物质未产生显著影响(P0.05);光照强度对三疣梭子蟹的肌肉乳酸含量产生显著影响(P0.05),1 500 lx下,蟹肌肉乳酸含量显著低于其他处理组(P0.05),说明该光照强度对蟹机体的胁迫小;1 500 lx光照下,蟹的HK和PK活力处在较高水平,表明机体糖酵解速率较高,产生更多的能量;SDH的活力处在较高水平,LDH处在较低水平,表明蟹的有氧代谢能力高,有利于蟹的持续运动。研究表明,1 500 lx光照下,三疣梭子蟹机体受到的胁迫小,整体代谢水平较高,是工厂化养殖较为理想的光照参数。     

盐度对三疣梭子蟹生长、蜕壳及能量利用的影响

在实验室条件下,研究了盐度(15,20,25,30,35)对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹生长、蜕壳和能量利用的影响,探讨了三疣梭子蟹生长的最适盐度、蜕壳与生长的关系以及不同盐度水平下蟹的蜕壳同步性。实验时间为50 d,结果显示:1、盐度显著影响三疣梭子蟹的摄食、生长和能量利用。盐度20、25和30组,三疣梭子蟹的日摄食率(FId)较小,但其食物转化效率(FCEd)较高,其中盐度30组蟹的食物转化效率显著高于盐度15和35组(P<0.05),与盐度20和25组差异不显著(P>0.05)。盐度20、25和30组的能量吸收效率(K1)和净生长效率(K2)显著高于盐度15和35组。实验结束时,盐度30组三疣梭子蟹获得了较高的湿重、相对增重率和特定生长率,且显著高于盐度15和35组(P<0.05),而与盐度20和25组间的差异不明显(P<0.05)。回归分析表明,当水体盐度为26.3时,三疣梭子蟹特定生长率(SGRd)最大。2、不同盐度下,三疣梭子蟹幼蟹从Ⅶ期生长到Ⅹ期的蜕壳周期为18.9~23.5 d,各盐度组间的差异不明显(P>0.05),但盐度30组三疣梭子蟹蜕壳周期较其他盐度组缩短了3.1~4.6d。低盐(15)下,三疣梭子蟹出现MDS(蜕壳未遂)死亡,蜕壳受到抑制;而高盐(35)则抑制三疣梭子蟹新壳的硬化,盐度20和25组三疣梭子蟹的蜕壳同步性较好。实验结果初步表明,养殖生产中水体盐度控制在25左右有利于三疣梭子蟹的蜕壳同步及生长。     

温度对三疣梭子蟹呼吸代谢及其相关酶活力的影响

为研究温度对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus呼吸代谢的影响,以三疣梭子蟹幼蟹(1.17±0.03)g和成蟹(57.57±1.16)g为实验材料,设5个实验温度水平(15、18、21、24、27℃),测定其在不同温度下的耗氧率和排氨率以及成蟹肝胰脏和肌肉组织中的丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)和琥珀酸脱氢酶(SDH)的活力。实验结果显示,三疣梭子蟹耗氧率和排氨率均随温度的升高而升高。幼蟹耗氧率在各个温度水平下差异显著(P0.05),成蟹耗氧率仅在15-18℃与21-27℃之间差异显著(P0.05);幼蟹和成蟹排氨率在15-18℃与21-27℃之间差异显著(P0.05)。幼蟹和成蟹的氧氮比随温度的升高总体呈下降趋势,其氧氮比范围为1.38-3.02,表明三疣梭子蟹以蛋白质为主要代谢能源物质。随实验温度升高,成蟹肝胰脏中的PK活力呈上升趋势,而成蟹肌肉组织中的PK和HK的活力则随温度升高总体呈下降趋势。温度对三疣梭子蟹肝胰脏组织中SDH的活力影响显著(P0.05),SDH的活力随温度的升高呈上升趋势,在27℃时达到最大值。综上所述,无氧代谢方面,随实验温度的升高,三疣梭子蟹成蟹肝胰脏组织的糖酵解速率增大,肌肉组织对葡萄糖的利用能力下降;有氧代谢方面,成蟹肝胰脏SDH活力随实验温度的升高而升高,一定程度上反应了三疣梭子蟹在高温环境下有氧代谢加强。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

水体盐度对雌性三疣梭子蟹生长、卵巢发育、渗透压调节、代谢和抗氧化能力的影响

为研究长期盐度适应对雌性三疣梭子蟹生长、卵巢发育、渗透压调节、代谢和抗氧化能力的影响,本实验设置了不同盐度(10、15、20和25)的水体,对生殖蜕壳后三疣梭子蟹雌体进行60 d的盐度适应实验。结果显示:(1)雌蟹的成活率、增重率、特定生长率和性腺指数随水体盐度的升高而显著上升。(2)血清渗透压、Na~+、Cl~–、Ca~(2+)、Mg~(2+)、大部分游离氨基酸和总游离氨基酸含量及后鳃Na~+/K~+-ATP酶活性均随水体盐度的升高而显著上升。(3)血清中葡萄糖和肝胰腺乳酸含量随水体盐度的升高而显著降低,而血清中的尿素氮、尿酸及肝胰腺中的尿酸含量均随水体盐度的升高而显著上升;肝胰腺中的甘油三酯、总胆固醇和尿素氮含量均在20和25盐度组较高。(4)10盐度组血清和肝胰腺中的总超氧化物歧化酶活性显著低于其他组,而血清中的总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶、γ-谷氨酰转肽酶、血蓝蛋白和肝胰腺中的谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛水平均在10盐度组最高。研究表明,水体盐度升高可促进三疣梭子蟹生长和卵巢发育;在20和25盐度条件下,雌蟹机体的代谢水平和氧化胁迫较低。     

盐度骤变和渐变对三疣梭子蟹幼蟹发育和摄食的影响

为探讨三疣梭子蟹幼蟹对盐度的适应性,设置盐度骤变和渐变2组试验.骤变试验以27为基础盐度,幼蟹直接转入7、11、15、19、23、31、35、39、43、47、51盐度水体中;渐变试验盐度从27开始,以4/d的日变幅逐渐升至51和降至7,分析不同处理下幼蟹存活率、变态率及摄食量的变化.试验结果表明,I期幼蟹盐度从27骤变为11～23后,120 h存活率≥50%,骤变为35～47,72 h存活率均降至10%,96 h内幼蟹全部死亡.Ⅱ期幼蟹盐度骤变为7、47、51后,96 h存活率分别为40%、20%、0%,其他处理存活率≥50%.I期幼蟹盐度骤变为11～31时,变态率≥40%,其他处理均为0%;Ⅱ期幼蟹盐度骤变为11～39时,变态率≥40%,其他变态率为10%～30%(51处理组除外,为0%).盐度骤变试验组存活幼蟹平均摄食卤虫成体1～3.17个.盐度突降＜16或突升＜8时,幼蟹的摄食量高于其他盐度骤变组.盐度渐变对幼蟹存活率、变态率和摄食量的影响均小于相应盐度下的骤变组.幼蟹适应盐度渐变的能力强于骤变;在盐度的降低或升高变化中,幼蟹能较好的适应盐度降低;幼蟹的盐度适应能力随发育呈增强趋势.15～31为三疣梭子蟹幼蟹生长发育的适宜盐度.     

盐度胁迫对三疣梭子蟹血清非特异性免疫因子的影响

采用紫外分光光度法和酶学分析方法研究了盐度(14和36)胁迫下12 h内经溶藻弧菌筛选过的三疣梭子蟹F2代(简称筛选蟹F2)的血蓝蛋白含量及血清酶活力的变化,用普通三疣梭子蟹F1代(简称普通蟹F1)作对照。试验结果表明,在高盐和低盐短时胁迫下,筛选蟹F2和普通蟹F1的血蓝蛋白含量、3种保护酶(SOD、POD和CAT)和磷酸酶(ACP和AKP)活力随时间变化呈现有升有降的变化趋势。此外,无论在低盐还是高盐胁迫下,筛选蟹F2的血蓝蛋白含量和各项血清酶活力分别在0 h(正常水平)和盐度胁迫下均显著高于普通蟹F1(P<0.05)。低盐和高盐短时胁迫对三疣梭子蟹的非特异性免疫影响显著且表现出较强的应激反应;在正常和抗盐度胁迫下,筛选蟹F2的非特异性免疫比普通蟹F1更具优势。     

三疣梭子蟹“黄选1号”盐度耐受性分析

通过盐度突变和渐变两种方法测定了三疣梭子蟹"黄选1号"的盐度耐受性。盐度突变条件下,Ⅱ期幼蟹24、48、72h低盐半致死浓度分别为21.655、22.109、23.184;高盐半致死浓度分别为50.711、50.061、49.612。80日龄成蟹24、48、72h低盐半致死浓度分别为5.13、7.49、8.56;高盐半致死浓度分别为54.49、52.74、52.21。在逐渐降低盐度条件下,Ⅱ期幼蟹可在盐度6.7的海水中存活,而80日龄成蟹可在盐度为5.7的海水中存活;随着盐度逐渐升高,Ⅱ期幼蟹和80日零成蟹均可在盐度47.7的海水中存活。三疣梭子蟹"黄选1号"具有较宽的盐度耐受范围。     

海水污染区三疣梭子蟹高产育苗技术研究

三疣梭子蟹以其优良品质，在潍坊市已取代对虾成为主要池塘养殖品种，形成了以三疣梭子蟹为主，兼养日本对虾的海水养殖模式。潍坊市老弥河口地区，拥有海水养殖池5330公顷以上，年需蟹苗5000kg。该区现有海水育苗场8家，水体约1．9万m^3，均开展了三疣梭子蟹苗种生产。但由于近岸海水污染较重、盐度过高、水质极不稳定，生产屡遭失败，年产蟹苗只有1500kg左右。在此情况下，笔者于2003年3～6月利用-育苗场进行了三疣梭子蟹高产育苗生产试验，获得成功，现报告如下。     

光照对三疣梭子蟹幼体发育的影响

日本对虾幼体对日光的光照强度适应范围较广,可利用中国对虾育苗设施用自然光或在扇贝育苗池这样近黑暗的极弱光照环境下育苗,均能确保幼体的正常生长发育,出苗量相对稳定在５～７万尾／ｍ３左右。但对三疣梭子蟹幼体而言,光照的影响就显得尤为重要。国外有资料报道：“三疣梭子蟹幼体所需光照强度至少在１０００ｌｘ以上,以 ３ ０００ｌｘ为适;光照强度低,使幼体蜕皮和生长推迟”。究竟弱光照对三疣梭子蟹幼体生长发育影响程度如何,国内未见报道。笔者１９９９年利用扇贝育苗池进行三疣梭子蟹育苗,对此进行了试验,现报道如下：１…     

三疣梭子蟹蜕皮周期的分期

采用形态学特征观察法对三疣梭子蟹蜕皮周期的划分进行了研究,并将三疣梭子蟹蜕皮周期划分为蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期和蜕皮期。结果显示,根据甲壳硬度变化蜕皮后期被分成A期(身体各部位很软),B期(背甲边缘变硬,腮区、心区尚软);根据游泳足趾节末端新旧表皮基线间距/旧表皮厚度的比值(R值)结合解剖后新壳的生长状况,蜕皮前期被细分为D₀亚期(0<R≤0.4)、D₁亚期(0.4<R≤0.65)、D₂亚期(0.65<R≤0.9)、D3亚期(R≈1)和D₄亚期(R≈1,新旧壳可完全分离)5个亚期;头胸甲腹面和螯足长节背面蜕皮缝的裂开是进入蜕皮期的先兆。     

低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达

本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)蝗抗利尿肽(neuroparsin,PtNP)基因。该基因全长1920 bp,5￠端非编码区237 bp,3￠端非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 k D,理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基,具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明,PtNP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现,PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高,其次是鳃和眼柄,在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。通过分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达模式,整体呈现上调表达趋势,其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调至7.7倍、2.8倍和2.6倍,且存在显著差异(P0.05)。去除眼柄后该基因在鳃中的表达呈上升趋势,且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组(P0.05)。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。     

三疣梭子蟹氧化磷酸化代谢在家系近交中的变化

为探究近交对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)氧化磷酸化代谢的影响,首先克隆了三疣梭子蟹线粒体呼吸链4个复合体关键亚基基因的c DNA全长,分别命名为pt Ndufv2、pt SDHC、pt Cytochrome c1与pt COX6B。pt Ndufv2基因c DNA全长1005 bp,编码234个氨基酸,该蛋白是复合体Ⅰ的核心亚基Ndufv2;pt SDHC基因全长915 bp,编码由179个氨基酸组成的复合体Ⅱ关键亚基SDHC;pt Cytochrome c1基因全长2371 bp,编码由313个氨基酸组成的亚基Cyt c1;pt COX6B基因全长1171 bp,编码由105个氨基酸组成的COX6B亚基。生物信息学分析显示,这些复合体亚基基因进化上比较保守。酶活检测及RT-PCR结果表明,随着近交系数的增加,三疣梭子蟹肝胰腺中复合体Ⅰ、复合体Ⅲ活力分别从F4、F2开始呈现显著下降趋势(P0.05);F10复合体Ⅳ酶活力显著低于其余各代(P0.05);4个复合体基因表达量均显著下降,且各代表达量显著低于F0(P0.05)。在心脏中,复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活力分别从F2、F2、F6开始显著下降(P0.05);pt Ndufv2与pt Cytochrome c1基因表达量分别从F2、F4开始显著下降(P0.05),这一结果证实近交衰退已出现在三疣梭子蟹氧化磷酸化代谢通路。     

三疣梭子蟹微卫星标记与生长相关性状的相关性分析

选用35个多态性微卫星标记,对三疣梭子蟹人工选育快速生长自交家系F2代(以2008年莱州湾群体雄蟹为父本和海洲湾群体雌蟹为母本交配产生F1代,随机选取F1代后代进行交配产生F2代自交家系)的110个个体进行遗传多样性研究。结果表明:35个位点共检测出87个等位基因,各位点等位基因数为2~4个不等,平均有效等位基因数为2.2个,观测杂合度平均值为0.646 5,期望杂合度平均值0.513 0,多态信息含量平均值0.449 1。经卡方检验,多数位点显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)偏离Hardy-Weinberg平衡。采用SAS 9.1中的一般线性模型(general linear model,GLM)对微卫星标记与生长相关性状(全甲宽、甲宽、甲长、体高、体质量、第Ⅱ侧齿间距、第Ⅰ步足长节长、大螯长节长)进行连锁分析。结果表明,Pot08位点与体质量、全甲宽、甲长、体高、第Ⅱ侧齿间距显著相关(P<0.05),Pot42位点与体质量、甲长、大螯长节长、第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),Pot53位点与全甲宽、甲宽、大螯长节长显著相关(P<0.05),与第Ⅱ侧齿间距极显著相关(P<0.01),Pot57位点与第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),PTR8a位点与第Ⅰ步足长节长、体高、甲长显著相关(P<0.05),与体质量、第Ⅱ侧齿间距、全甲宽、甲宽极显著相关(P<0.01),PTR30位点与体质量和甲长显著相关(P<0.05),PTR131位点与体质量、全甲宽、甲宽显著相关(P<0.05)。其中,位点PTR8a可作为以体质量为选育目标的首选标记。     

三疣梭子蟹心激肽基因克隆及在低盐适应中的功能验证

采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)心激肽(CCAP)基因。该基因全长606 bp, 5￠端非编码区72bp,3￠端非编码区108bp,开放阅读框426bp,编码141个氨基酸,预测分子量15.6kD,理论等电点9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和蓝蟹(Callinectes sapidus)的CCAP同源性较高,分别为85%和82%。系统进化树分析显示,三疣梭子蟹与蓝蟹首先聚为一支,之后再与拟穴青蟹相聚。组织表达分析发现, CCAP基因在胸神经节中的相对表达量最高,其次是脑和眼柄组织。通过分析CCAP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐可显著改变CCAP在胸神经节中的表达模式,在24 h, 48 h和72 h实验组的表达量显著高于对照组(P0.05),分别为对照组的1.73, 2.16和2.19倍。体外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低盐条件下的死亡率,并诱发钠钾ATP酶(Na~+/K~+-ATPase)和V型ATP酶(V-ATPase)酶活力显著提高。本实验结果暗示CCAP通过调控Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力以达到盐度适应的作用。     

Effects of low salinity stress on immune response and evaluating indicators of the swimming crab Portunus trituberculatus

The purpose of the present study was to investigate the effects of salinity stress on immune responses and evaluating indicators in swimming crab Portunus trituberculatus. The crabs (150 ± 8.5 g in body weight) were exposed to different salinities as 21, 26 and 31‰ (control) for 6 days. The results showed the total haemocyte counts (THC) and prophenoloxidase (proPO) activity in the haemocytes decreased significantly in the treatment groups after 6 hr, and reached the lowest levels at 12 hr. The phenoloxidase (PO) activity in the plasma increased significantly and peaked at 12 hr, then recovered to control level after 24 hr. The phagocytic per cent of haemocyte, antibacterial and bacteriolytic activities in the plasma decreased significantly in the treatment groups, and reached the lowest level at 12 hr, then recovered to control level after 72 hr. The dopamine (DA) and 5‐hydroxytryptamine (5‐HT) contents in the plasma increased significantly and peaked at 12 hr, then recovered to control level, while the noradrenaline (NE) content in the plasma had no significant change throughout the duration of the experiment. The DA and 5‐HT receptors were significantly up‐regulated in the treatment groups. The highest value of mRNA expression of DA and 5‐HT receptors occurred at 12 hr and recovered to control level after 24 hr. In addition, the cAMP and protein kinase A (PKA) contents in the haemocytes increased significantly and peaked at 12 hr, then recovered to control level after 72 hr. The phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) contents in the haemocytes increased significantly and peaked at 12 hr, then resumed to control level after 24 hr. These results speculated that biogenic amine (DA and 5‐HT) is likely to play an important role in immune modulation via cAMP/PKA signalling pathway or PLC/PKC signalling pathway when P. trituberculatus is exposed to low salinity and these results will provide scientific data for immune evaluation.