19株海水鱼致病性弧菌OmpK基因序列及其抗原性分析

从哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)克隆、测定了共19株海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白OmpK基因序列,探讨其作为海水鱼类致病性弧菌共同抗原的分子基础.根据已知的弧菌外膜蛋白OmpK序列设计1对简并引物,利用聚合酶链式反应(PCR)方法从19株弧菌总DNA中分别扩增得到约800bp外膜蛋白OmpK的基因片段,将其克隆到pDM18-Tvector载体筛选阳性重组子进行序列测定.结果显示,OmpK基因分别含有786bp～849 bp的开放读码框,编码261～282个氨基酸,其核苷酸序列之间的相似性在72%～100%,推测氨基酸序列的相似性为71%～100%,且种内OmpK氨基酸序列的相似性比种间高.序列分析还表明,每一种弧菌OmpK基因都有一段特异性序列,可用于设计核酸探针或特异性引物来诊断、检测哈维氏弧菌等海水鱼致病性弧菌.本研究不仅从基因水平上证实了外膜蛋白OmpK广泛存在于海水鱼致病性弧菌中,而且证明了它们之间具有较高的相似性.由结果推测外膜蛋白OmpK是哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌的一种共同抗原,是较好的亚单位疫苗候选成分,为进一步研制广谱的海水鱼类致病性弧菌外膜蛋白基因工程亚单位疫苗提供了理论基础.     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

半滑舌鳎溃疡病病原菌的分离、鉴定及其致病性分析

采用2216E和TCBS培养基分别从患溃疡病半滑舌鳎的肠道和体表病灶分离获得菌株40株,经血平板检验分离菌株的溶血活性,体外筛选并鉴定出3株潜在致病性菌株,即哈维氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血性弧菌。通过将3株潜在致病菌与健康半滑舌鳎的肠道上皮细胞共培养,检测病原菌刺激后半滑舌鳎肠道上皮细胞相关免疫基因的相对表达量及共培养后肠道上皮细胞的凋亡率,对病原菌的致病性进行细胞水平的筛选。结果显示,经哈维氏弧菌刺激后肠道上皮细胞白介素10基因(IL-10)表达量极显著上调,说明哈维氏弧菌引起的共培养上皮细胞免疫反应最为剧烈,且哈维氏弧菌与肠道上皮细胞共培养后导致细胞的凋亡率高达48.3%,其次为溶藻弧菌(36%)和副溶血性弧菌(34.5%),推测哈维氏弧菌为半滑舌鳎溃疡病高致病性弧菌。通过对半滑舌鳎进行浸浴回感实验,结果发现,哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌人工回感后第6天半滑舌鳎的累计死亡率分别为100%、95%和75%,与细胞水平检测结果相吻合。实验表明,所筛选到的3株弧菌均具有较强的毒性和致病性,尤其以哈维氏弧菌致病性最强,并由此推测半滑舌鳎溃疡病可能由多种致病菌共同感染所致。     

Biolog GN法对不同地区养殖对虾弧菌区系的比较研究

采用Biolog细菌鉴定技术,分析来自5个国家的4个对虾养殖品种苗期及部分养成期虾体上的185株弧菌(其中24株来自成虾).结果表明:来源、种类不同的养殖对虾苗期的主要弧菌的区系组成相似,溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鲨鱼弧菌(V. carchariae)(即哈维氏弧菌V. harveyi)是普遍存在的种类,同一种对虾在不同地区养殖,其区系组成略有差异;哈维氏弧菌多为对虾苗期致病菌,副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)主要为成虾致病菌;在健康虾苗和发病虾苗体内都可分离到溶藻弧菌.     

5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌V. harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清,建立了5种菌的间接ELISA检测方法,并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示,5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102~107CFU/fish;制备的兔抗血清效价分别为1∶2 048 000、1∶16 000、1∶16 000、1∶1 024 000、1∶128 000;交叉反应结果显示,鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌3株弧菌与抗血清相互之间存在交叉反应;抗血清特异检测灵敏度分别为104、108、107、105、106cell/ml;对13株海水鱼类细菌分离物进行检测,有1株腐败希瓦氏菌阳性,两株哈维氏弧菌阳性;1株副溶血弧菌和哈维氏弧菌均为阳性,该结果与16S rDNA序列的分子分析方法一致。     

养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌.本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法.经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3种致病弧菌核酸的阳性对照样品分别扩增出大小为737 hp、382 bp和271 bp的预期产物,其灵敏度是102～102 CFU/mL.将该方法应用于检测人工感染后的养殖大黄鱼病鱼肝脏和肾脏,结果在6份组织样本中,5份检出原始感染菌株,与API 20E鉴定结果相符;对弧菌病流行季节采集的未发病的16份养殖大黄鱼组织样本和16份水体样本进行抽检,结果在1份大黄鱼组织样本中检出哈维氏弧菌,7份水体样本中检出这3种弧菌中的1种或2种,鉴定结果与API 20E鉴定结果符合率为93.75%.说明该方法不仅可以检测发病鱼,还可以检测无病症带菌大黄鱼以及带菌水样,且说明海洋水体中存在着大黄鱼弧菌病的致病菌.结果说明,多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,可以缩短检测时间,降低检测成本,该方法的建立对养殖大黄鱼弧菌病的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义.     

海水网箱养殖许氏平鲉细菌性疾病病原鉴定及致病性研究

2019年8月,大连市金州区大李家街道海域海水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重的皮肤溃疡性疾病。以其为研究对象,从体表病灶、肝脏和肾脏上进行细菌分离,得到1株优势菌株BN-1910。为了验证网箱养殖许氏平鲉死亡是否由该菌株引起,采取腹腔注射的方式进行该菌株回感,以确定该菌株的致病力。在对菌株进行生理生化检验和形态学观察后,可以初步判断菌株为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。基于16S rRNA基因序列构建的分子系统发生树表明,哈维氏弧菌(MT864681.1)和该菌株在系统发育树中聚为一支,99%置信水平。研究结果显示,菌株BN-1910为哈维氏弧菌(V.harveyi),对许氏平鲉10 d的LD50为7.98×10^3 CFU/mL;对14种药物的敏感试验证实,菌株BN-1910对氟哌酸、链霉素和左氧氟沙星敏感。     

哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备

用18~20nm胶体金标记抗哈维氏弧菌Vibrio harveyi抗体并制备金标垫,分别将羊抗兔Ig G和纯化后的抗哈维氏弧菌抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,组装制作了哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条,优化了该试纸条的制作条件,测试了其性能。结果表明:所制备的哈维氏弧菌免疫层析试纸条具有较好的特异性,与费尼斯弧菌Vibrio furnissii、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae、类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides、鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila等9种常见水产病原菌无明显交叉反应,检测灵敏度为3×105CFU/m L,5~10min即可得出检测结果,具有快速、简便、特异性强和适应基层推广应用等优点,可用于养殖鱼类病原哈维氏弧菌的现场检测。     

水产动物哈氏弧菌病及其防治方法

哈氏弧菌又称哈维氏弧菌,也有的将其记作夏威夷弧菌;以前曾由Johnson等将其命名为哈氏贝内克氏菌,1981年Baumann等将其正式归于弧菌属并命名为哈氏弧菌。该菌是一种具有发光特性的弧菌,是海水微生物区系的正常成员,也是海水中一种常见的致病菌,主要引起虾及鱼类的感染发病。     

3株噬菌蛭弧菌裂解特性及在水体中的应用研究

对从海水中分离的3株噬菌蛭弧菌Blb-1、Blb-2、Blb-3在不同条件下的裂解特性进行了初步研究,并进行了Blb-2裂解水体哈维氏弧菌的应用试验。结果表明,3株菌在盐度为0~30时均能良好生长,具有广盐性;3株菌对灭活后的宿主菌具有更强的裂解作用,形成噬菌斑的时间普遍提前,且噬菌斑较大;3株蛭弧菌的裂菌谱试验以及不同蛭弧菌菌龄的裂解效果试验表明,3株菌对气单胞菌属和弧菌属细菌均有很好的裂解能力,而对水产益生菌芽孢杆菌、乳酸菌等裂解能力很弱;应用试验表明,噬菌蛭弧菌对水体中的哈维氏弧菌具有较强的的清除能力。     

溶藻弧菌相关分离株的分子及VITEK鉴定

哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群,包括溶藻弧菌在内的6个种在表型和遗传型上均十分相似,要准确鉴定各种有一定难度。看家基因的研究及生化鉴定系统的出现为弧菌鉴定提供了多种方法,本文比较了16S rRNA基因、toxR基因和pyrH基因以及VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。哈维群弧菌基因组内16S rRNA基因是多拷贝的,且拷贝间序列差异大于种间差异,不适用于种的鉴定。单拷贝基因toxR和pyrH序列种内差异均小于种间差异。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种;toxR基因系统发育学分析也显示,哈维群弧菌各种独立地聚类分支,且溶藻弧菌种内存在两个明显的聚类分支,说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到类似的结果,但pyrH基因具有较强的保守性,因而分辨力稍低于toxR基因。VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率,且鉴定谱较窄。因此,建议在实际应用中采用toxR基因比对作为溶藻弧菌快速鉴定的主要手段,可再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。     

Comparative analysis of genome of Edwardsiella tarda by BOX-PCR and PCR-ribotyping

The Genus Edwardsiella comprises of bacteria differing strongly in their biochemical characteristics, physiological features, natural habitat and pathogenic properties. The most common species of the genus is Edwardsiella tarda, recovered from a variety of environmental and animal sources. In this study 51 isolates including one reference strain obtained from freshwater culture systems were analyzed for their genomic diversity by BOX-PCR and PCR-ribotyping. By comparison of fingerprint of different isolates 27 and 32 genotypes were obtained by PCR-ribotyping and BOX-PCR respectively. Cluster analysis of genetic profile obtained by BOX-PCR and ribotyping clearly showed 9 and 8 clusters respectively. Some correlation between BOX-PCR and ribotyping was observed. Several clusters delineated on the basis of source of isolation in the dendrogram by BOX-PCR with 70% cut off value had corresponding clusters in the ribotyping with 50% cut off value. Some of the genotypes were found to be habitat specific. However, there was mixing and dispersal of most of the genotypes obtained from water, sediment and fish samples. Of both the techniques, BOX-PCR was found to be more discriminating than ribotyping.     

斜带石斑鱼3种致病性弧菌的分子生物学鉴定

从患病斜带石斑鱼分离到3株病原菌EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801,经常规生理生化鉴定均属于弧菌属的种类。为了进一步确定其分类地位,测定了3株病原菌的16SrRNA和HSP60(heat shock protein,HsP60)基因部分序列。16SrRNA基因系统进化分析表明,3株病原菌与哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌亲缘关系较近,相互之间同源性均大于98．6％,差异不明显。HSP60基因序列分析表明,菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801 HSP60基因序列分别与哈维氏弧菌(AF230934)、溶藻弧菌(Ab230931)、副溶血弧菌(AF230951)HSP60基因的同源性最高,依次为95．7％、99．8％和99．8％,而与其它弧菌HSP60基因的同源性均低于90．6％,3株病原菌相互之间的同源性低于91．0％。HSP60基因构建的系统进化树表明,EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801分别与Vibrio harveyi、Vibrio alginolyticus、Vibrio parahaemolyticus聚类。综合上述结果,菌株EcGS020802、EcGS021001、EcGS020801可分别鉴定为哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌。结果表明,HSP60基因比16SrRNA基因更适合用于海水鱼致病性弧菌种问的分类研究。     

~(60)Co-γ射线对长毛明对虾诱变后子代幼体遗传变异的RAPD分析

本文首次使用60Co-γ射线对长毛明对虾进行诱变,将性腺成熟的长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)分为四组进行不同剂量的60Co-γ射线照射,采用RAPD技术对诱变子代的无节幼体基因组DNA多态性进行了检测。遗传相似系数用Nei的计算方法进行计算,遗传距离则用Lynch的计算方法进行计算。从20个随机寡核苷酸引物共检测154个位点,其中多态位点103个,占66.9%。单个引物获得的标记为4~11个,平均7.7个,分子量在100~2500bp之间。计算得到的遗传相似系数变化范围在0.7995~0.8696之间,相应的遗传距离变化范围则在0.1397~0.2288之间。实验表明:诱变子代与正常对照组相比,遗传多样性水平较高,诱变产生了较为显著的变异。     

雌核发育鲢RAPD指纹和蛋白质电泳研究

用２３个随机引物对雌核发育鲢子一代（普通鲢作对照）进行了ＲＡＰＤ—ＰＣＲ反应,在２３个引物中除一个引物无扩增产物外,其它均可得到１～１０条ＤＮＡ带,平均每个引物产生５３８条带。其中７个引物产生多态现象,占总引物的３１４％。多态座位达１３６８％。用Ｓｈａｎｎｏｎ指数对ＲＡＰＤ数据进行遗传多样性（Ｈｏ）分析,得出所研究样本的Ｈｏ为０１７５。用血清酯酶和血清蛋白电泳作对比时没有发现在蛋白质水平的多态现象,说明ＲＡＰＤ技术是一种比较灵敏实用的ＤＮＡ多态检测方法。以ＲＡＰＤ所得数据进行了雌核发育鲢子代和普通鲢个体间的遗传相似性与遗传距离分析,为鲢选育提供了依据。     

长吻遗传多样性的RAPD分析

以洞庭湖和原种场长吻（Leiocassis longirostris）为研究对象,采用20个随机引物对10个野生个体进行了随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）群体遗传多样性分析。共检测到103条带,每个引物产生的条带数在2～9之间,片段大小在0.2～3.0kb之间,多态座位比例为41.75%,2群体内个体间遗传相似系数和遗传距离分别是,洞庭湖个体间遗传相似性系数（S）0.8795～0.9833,遗传距离（D）0.0167～0.1205;原种场个体间S为0.8794～0.9892,D为0.0319～0.1108;比较2群体S为0.7983～0.9994,D为0.0167～0.3017;Nei遗传多样性指数（He）0.3269。结果表明,长吻群体内遗传多样性较为丰富。     

鲫鱼种群的随机扩增多态DNA与遗传多样性分析

利用ＲＡＰＤ技术检测了两个不同水域（天津于桥水库和独流碱河）鲫鱼种群的基因组ＤＮＡ的多态性。用４５个１０ｂｐ的引物对实验鱼的基因组ＤＮＡ进行扩增。实验结果经统计分析得出：种群间ＲＡＰＤ标记的相似率为８４．２％,遗传距离为０．１５８,而上述两个种群内的相似率分别为９４．３％和９３．５％,遗传距离为０．０５７和０．０６５。表明这两个鲫鱼种群内的遗传多态性贫乏,而种群间具有一定的遗传多样性。     

Physiological characterization of Saprolegnia parasitica isolates from brown trout

Saprolegnia parasitica has caused large mortalities in brown trout, Salmo trutta, in Spain. Several strains of Saprolegnia parasitica have been isolated from these epizootics and characterized regarding their physiological adaptation and genetic diversity. These isolates exhibit similar physiological characteristics, i.e. radial growth, zoospore mobility and germination after encystment and differ substantially from other strains of the Saprolegnia diclina-parasitica complex tested. Random amplification of polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) of total DNA revealed a genetic similarity of about 85–100% between Spanish trout isolates whereas only 20–45% similarity to other strains of the Saprolegnia diclina-parasitica complex was found. The results suggest that the Spanish isolates are closely related strains and that they might have originated from one clone.     

长江中上游南方鲇遗传多样性的RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对取自长江中上游合川、木洞、涪陵、彭水、巫山、宜昌及岳阳7个江段的南方鲇(Silurus meridionalisChen)野生群体的遗传多样性进行了分析,24个随机引物共检测出327个位点(200~2500 bp)。各群体的多态位点比例在28.75%~48.62%之间,基因多样性指数为0.2047~0.3074。遗传距离显示长江中上游南方鲇各群体间有一定遗传分化,其中,木洞和合川群体间遗传距离最小为0.0537),而合川和岳阳群体间的遗传距离最大(0.1205),群体间遗传分化系数为0.1866。聚类分析(UPGMA)显示,7个群体聚为两大类群,合川和木洞亲缘关系最近,首先聚在一起,之后与彭水、涪陵、巫山群体相继聚类形成类群Ⅰ,岳阳和宜昌群体则聚类形成类群Ⅱ。Shannon指数分析表明,长江中上游南方鲇野生群体间种质资源状况良好,遗传多样性水平较高。     

RAPD fingerprinting of the eel-loaches Pangio filinaris and Pangio piperata: preliminary evaluation

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was applied to two morphologically similar species of the increasingly popular ornamental eel‐loaches, Pangio filinaris and P. piperata, collected from Kemat River, Terengganu and Padang Sanai River, Kedah, West Malaysia. Forty primers were tested in a preliminary screening. Of these, five (OPA‐03, OPA‐09, OPA‐11, OPA‐13 and OPA‐18) were chosen for their ability to provide consistent amplification. RAPD analysis differentiated the two species, with each showing different RAPD patterns for each primer used. The five primers generated a total of 82 scorable loci with up to 83% and 60% polymorphism in P. piperata and P. filinaris respectively. The RAPD banding patterns of these two species ranged from 2 to 14 fragments, with a size range of 250–2000 bp. Genetic similarity within species ranged from 0.610 to 0.985 (mean 0.799±0.14) for P. piperata and from 0.824 to 0.934 (mean 0.885±0.04) for P. filinaris respectively. The interspecies genetic similarity ranged from 0.386 to 0.486 with an average value of 0.434±0.040. Our study revealed RAPDs as useful genetic markers for the taxonomic clarification and assessment of genetic variability of the eel‐loaches.