Cre／loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

位点特异性重组系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入或删除,已成为植物遗传操作中的重要工具。本文简要介绍目前应用最为广泛的Cre/loxp位点特异性重组系统的重组机制,并着重阐述Cre/loxp系统在删除转基因植物中标记基因及定点整合等方面的应用。     

Cre/loxP位点特异性重组系统在植物中应用的研究进展

Cre/loxP位点特异性重组系统自发现以来,在植物基因重组领域得到了广泛应用,已成为提高转基因植物安全性的有效方法。本文介绍了该系统的基本概况及其在转基因植物表达载体构建方面的应用,尤其是在基因删除、定点整合、多基因表达以及杂种优势利用等方面的应用做了重点阐述。     

利用Cre/lox重组系统建立番茄基因工程雄性不育恢复系

 【目的】利用Cre/lox重组系统具有的重组删除特性建立番茄工程恢复系,特异删除F1中的雄性不育基因恢复其育性。【方法】将TA29-Barnase雄性不育基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与NPTⅡ基因、Bar基因融合后获得植物表达载体pBinBarloxTABn,转化番茄获得雄性不育转基因植株。Cre基因在 CaMV35S启动子的驱动下转入番茄获得工程恢复系。两者在开花时进行杂交,利用Cre重组酶删除F1中的TA29-Barnase不育基因表达盒使育性恢复。【结果】利用NPTⅡ作为转化筛选标记基因获得了番茄雄性不育转基因植株。转基因植株中的Bar基因能正常表达,真叶叶盘在含PPT 3 mg?L-1（phosphinothricin）分化培养基上能分化愈伤组织及芽;真叶具有抗PPT 20 mg?L-1浓度以上的能力。获得的TA29-Barnase转基因植株表现雄蕊退化、无花粉产生或产生少量形状畸形且无生活力的花粉。雄性不育植株自花授粉不能坐果,用非转基因保持系花粉授粉后,果实正常膨大结籽,杂交后代对除草剂Basta的抗性按1﹕1分离。不育植株与Cre转基因工程恢复系杂交后,果实也正常膨大结籽。对不育植株与Cre转基因工程恢复系杂交后代进行分子检测,结果发现同时含Bar 基因和Cre基因F1植株中的TA29-Barnase雄性不育基因被精确删除。TA29-Barnase基因删除植株育性被恢复,能正常开花结果。【结论】利用Cre/lox重组系统建立的Cre工程恢复系成功将番茄F1代中的不育基因删除,恢复了 F1的育性。该研究结果为植物基因工程雄性不育系的育性恢复提供了一条新的途径。     

Cre/Loxp重组酶系统与转基因

Cre/Loxp重组酶系统是一种对转入基因进行组织特异性、定点操作的基因重组系统。该系统可以迅速有效地进行基因的整合性删除、条件性重组、染色体易位等方面的研究,从而可以将其应用于转基因动物和植物领域。     

Cre重组酶的研究进展

Cre重组酶来源于噬菌体P1基因组中的一段DNA序列编码的蛋白,是一种无需辅助因子即可进行位点特异性重组的生物酶。它的发现为基因靶位操作创造了有利条件,由于其作用方式高效简单,Cre定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用,文章就Cre重组酶的结构、功能、突变分析和改造及Cre重组酶的应用潜力等方面的研究进行了综述。     

FLP/FRT位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展

 来源于酵母2 μm质粒的FLP/FRT位点特异性重组系统已经被广泛应用于拟南芥、水稻、小鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物,正逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。笔者综述了FLP/FRT系统的重组原理及其在高等真核生物中的应用,系统地概述了该系统在转基因植物、哺乳动物、昆虫以及其它相关高等真核模式生物中的研究现状,讨论了FLP/FRT系统在研究中存在的主要问题、应用前景和发展方向。     

利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin 38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8 mg•L-1 PPT（phosphinothricin）的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。     

基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系

 【目的】通过构建能够在植物生长发育阶段经乙醇诱导将选择标记基因删除的载体,消除选择标记基因带来的潜在安全隐患。【方法】利用AlcR/alcA诱导系统和Cre/loxP位点特异性重组系统删除选择标记基因。当外源诱导物乙醇存在时,激活下游Cre的表达。Cre重组酶识别2个同向loxP位点,剔除位点之间的DNA片段,包括选择标记基因、AlcR/alcA系统和Cre/loxP系统,而目的基因gus在诱导前后均为组成型表达。【结果】拟南芥转基因植株受乙醇诱导严格控制Cre表达的“开”和“关”。经诱导的转基因植株不能在选择培养基上继续生长。分子生物学检测显示,2个同向loxP位点间序列均已删除,表明标记基因删除效果明显。【结论】基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系切实可行,有广泛的应用前景。     

基于Cre/loxP重组系统的多基因载体构建及烟草转化研究

利用一套基于Cre/loxP重组系统的植物多基因表达载体系统将苏云杆菌毒蛋白基因(BtCryIAc)、甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、GA20氧化酶基因(pttGA20ox)和rolB基因构建于植物表达载体pYL1305上,命名为pYL1305BBGR。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经PCR和Southern blot检测发现,多基因已成功转入烟草基因组中;经半定量RT-PCR检测证实,4个基因均能正常表达。     

Construction of Marker-Free GFP Transgenic Tobacco by Cre/Iox Site-Specific Recombination System

Marker-free GFP transgenic tobacco plants were constructed based on Cre/lox site-specific recombination system. A GFP gene was introduced into the tobacco genome using the Bar gene as a linked selectable marker flanked by recombination sites in a directed orientation. The Bar gene expression box was subsequently excised from the plant genome by a strategy of Cre gene retransformation. After removal of the Cre-NPT Ⅱ locus by genetic segregation through self-cross, plants that incorporated only the GFP transgene were obtained. Transgenic tobacco plants mediated by Agrobacterium tumefaciens were obtained, which resisted herbicide Basta and GFP expressed well, then the Cre gene was subsequently introduced into 5 plants of them, respectively, by retransformation. The leaf disks from Cre transgenic plants were used to test the resistance to Basta on the medium with 8 mg L-1 of PPT. The results showed that few discs were able to regenerate normally, and the excision at 76-100% efficiency depended on individual retransformation events. Evidence for a precise recombination event was confirmed by cloning the nucleotides sequence surrounding the lox sites of the Basta sensitive plants. The result indicated that the excision event in the recombination sites was precise and conservative, without loss or alteration of any submarginal nucleotides of the recombination sites. Bar gene excised plants were selfpollinated to allow segregation of the GFP gene from the Cre-NPT Ⅱ locus. The progenies from self-pollinated plants were scored for Kan senstivity, then the segregation of GFP gene from Cre-NPT Ⅱ locus in the Kan senstive plants were confirmed by PCR analysis subsequently. Hence, constructing marker-free transgenic tobacco plants by Cre/lox sitespecific recombination system was reliable, and the strategy presented here should be applicable to other plants for the construction of marker-free transgenic plants as well.     

噬菌体phiC31位点重组酶系统在植物转基因中的应用

来源于链霉菌属噬茵体（streptomyces phage）的phiC31定点重组酶系统可诱导重组位点attB（细菌基因组）和attP（噬菌体）之间DNA序列的重组,该重组酶是继Cre／lox重组酶系统和FLP／frt重组酶系统之后的又一种新型位点重组酶系统,在原核和真核生物基因整合、删除和倒位等方面得到广泛应用。文中主要对phiC31重组酶系统的来源、结构特性以及在植物转基因中的应用研究进展进行综述,为phiC31定点重组酶的进一步开发利用提供依据。     

Cre／loxp重组系统在转基因植物中删除标记基因的应用

在植物遗传转化中,标记基因是必须的,但标记基因的存在引起人们对转基因食品安全性的关注。Cre／loxp重组系统可用于删除转基因植物中的标记基因,可以通过杂交或二次转化,或瞬时表达、诱导表达、组织特异表达重组酶来获得无标记基因的转基因植株。