水稻OsWAX2—1基因过表达及RNAi研究

为了研究水稻OsWAX2-1基因的功能,采用农杆菌介导法,以日本晴为材料,利用OsWAX2-1基因过表达及RNAi载体进行了遗传转化,并以PCR及半定量RT-PCR方法对具有Hyg抗性的转基因水稻植株进行了检测,结果表明:OsWAX2-1基因及RNAi片段均已整合到水稻基因组,RT-PCR检测到转OsWAX2-1基因在T1代转基因水稻中有不同程度的过表达,为进一步研究OsWAX2-1基因的功能奠定了基础.     

OsWAX2基因的植物表达载体构建及遗传转化

利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-2,pOEOSW2-3及3个RNAi表达载体pCROSW2-1,pCROSW2-2,pCROSW2-3,并通过冻融法将6个表达载体转化到根癌农杆菌EHA105,LBA4404和GV3101中,采用农杆菌介导法进行水稻日本晴品种的遗传转化,得到了具有Hyg抗性的水稻转基因苗,PCR检测到阳性植株.     

高羊茅遗传转化研究进展

近十几年来,高羊茅的遗传转化技术得到迅速发展。综述了高羊茅的主要遗传转化体系和转入高羊茅的外源基因,并探讨了影响农杆菌介导高羊茅遗传转化效率的因素。     

根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究

以'美人指'葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究.结果表明:最佳的农杆菌介导'美人指'葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,预培养3 d,卡那霉素选择压3.0 mg·L-1,头孢霉素质量浓度250 mg·L-1.采用此体系对'美人指'葡萄进行转化,共获得了12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%.利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中只有2株GUS染色呈阳性,阳性率为16.67%;有3株通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入'美人指'葡萄基冈组中.     

超声波辅助农杆菌介导的长春花（Catharanthus roseus）遗传转化

研究以根癌农杆菌介导结合超声波处理和乙酰丁香酮诱导,通过对GUS基因瞬时表达来研究影响长春花转化效率的因素.对转化方法包括超声波处理的功率和时间、乙酰丁香酮(3,5-methoxy-4-hydroxyacetophenone,AS)的浓度、共培养时间进行了系统优化.结果表明:在添加AS 100 p,mol·L-1的1/2 MS培养液中,超声波处理功率80 W,处理时间10 rain,共培养2 d,根癌农杆菌介导的长春花下胚轴遗传转化能获得最佳的GUS基因瞬间表达率.本研究为进一步开展根癌农杆菌介导稳定转化长春花奠定了基础.     

根癌农杆菌介导的苦瓜遗传转化

用含质粒载体pB I121的根癌农杆菌转化“南屿”苦瓜子叶节,通过对gus基因瞬时表达情况进行观测,对根癌农杆菌介导的苦瓜遗传转化体系相关因素进行研究.结果表明,苦瓜子叶节必须预培养3 d左右,用D600nm值为0.3-0.5之间的菌液浸泡,侵染时间为10 min,然后共培养3-4 d.再生植株经PCR检测初步证明gus基因已成功整合到苦瓜基因组中.     

根癌农杆菌介导的悬铃木叶片遗传转化体系研究

以葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因瞬时表达率为指标,研究了不同因子对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的悬铃木叶片遗传转化系统的影响.结果表明,预培养9 d的悬铃木叶片在OD600值为0.7的根癌农杆菌菌液中浸染10 min后,再在含有100μmol.L-1的乙酰丁香酮的共培养培养基上黑暗条件下共培养3 d叶片的遗传转化效率最高.该体系为进行农杆菌介导目的基因培养悬铃木新品种奠定了基础.     

农杆菌介导北方粳稻转化体系的研究

通过农杆菌介导的方法将Bar-Bt基因（抗除草剂基因和抗虫基因构建在同一载体上的双基因）整合到北方优质粳稻龙稻6号、松粳9号等品种中;分别以供试品种的幼胚和成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携带有Bar-Bt基因双元载体PCAMBIA1301号的根癌农杆菌EHA105为载体,GUS基因的瞬时表达率为衡量指标,对影响农杆菌介导的龙稻6号、松粳9号等品种的转化效率的主要因素进行了研究。结果表明：农杆菌侵染愈伤组织的菌液浓度以D（600nm）=0.8～1.0较为适宜,最佳共培养时间为2～3 d,预培养时间为5 d,共培养培养基中添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的转化效率有明显提高。     

农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LycB转化菊花的研究

以菊花愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法,利用番茄红素β-环化酶基因(LycB)对菊花进行转化,以抗性愈伤率为指标,探讨了侵染时间、共培养时间、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮(AS)浓度等因素对转化的影响,建立了LcyB基因转化菊花的遗传转化体系。结果表明：农杆菌侵染菊花愈伤组织的最佳时间为5min;农杆菌菌液浓度OD600值0．55;愈伤组织与农杆菌共培养的时间以3d效果最好;添加AS可提高抗性愈伤率,适宜的AS浓度为100μmol／L;采用Hyg浓度由低到高的筛选方式可有效提高抗性愈伤率;PCR分子检测初步证明目的基因LycB已转入菊花愈伤组织中。     

辐照对高羊茅愈伤组织诱导及农杆菌介导转化的影响

以高羊茅成熟种子及产生的愈伤组织为试验材料，研究了辐照对愈伤组织诱导和农杆菌介导转化的影响。结果表明，5—20Gy辐照对高羊茅成熟种子诱导愈伤组织有一定的促进作用，使出愈率比对照提高4．7％-12．3％，其中以10Gy处理的效果最好，剂量超过30Gy对愈伤组织形成产生抑制作用。其转化前，愈伤组织被1-4Gy的剂量辐照处理，其GUS瞬间表达率随剂量的增加逐渐提高，但当剂量高于4Gy时，愈伤组织的GUS瞬间表达率随剂量的增加而下降。综合考虑辐照后愈伤组织的存活率和GUS瞬间表达率，2Gy为高羊茅愈伤组织转化的最佳剂量。深入观察表明，辐照后继代培养24h最适合农杆菌介导感染。