正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106 PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000 bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23.3% ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9% ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（EST contig110和EST contig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列EST contig110和EST contig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对EST contig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

黄瓜幼果cDNA文库构建与EST测序分析

将黄瓜授粉前后多个发育阶段的幼果组织等量混合后提取总RNA和mRNA,以λTriplEx2为栽体、XL1-Blue为宿主茵,构建了1个黄瓜幼果cDNA文库;其滴度为1.165×106pfu/mL,重组率在94.4％左右.测序获得116条EST,92.2％的长度在400 bp以上,19％为重叠序列.在GenBank中进行BLAST分析后确认与已知功能基因相似的EST序列有71条,有相似序列而功能未知的基因和没有相似序列的EST序列各占19.83％和18.97％.从对文库的检验结果看,构建的cDNA文库重组率较高,库容达到预期要求.     

小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库构建及表达序列标签分析

【目的】了解小麦受条锈菌诱导后的基因表达情况,从分子水平揭示寄主与病原菌非亲和互作机理。【方法】以小麦品种水源11和条锈菌CY23号小种组成的非亲和组合为材料,利用SMART技术构建条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库。随机挑取克隆测序,对其中获得的507条高质量表达序列标签（EST）进行生物信息学分析。【结果】得到原始文库的滴度为1.2×106 pfu•ml-1,扩增文库滴度2×109 pfu•ml-1,重组率97%,插入片段大小为0.4～3 kb。对获得的237个非重复序列进行BLAST分析,已知功能基因大部分与能量代谢、蛋白质合成修饰及 加工、转运、信号转导、防卫反应等相关。【结论】该cDNA文库质量较高,信息丰富,获得的已知功能基因中能量和代谢相关约占40%,抗病与防御相关约占17.1%,这些信息有利于在分子水平上研究小麦与条锈菌互作机制,为进一步克隆小麦与条锈菌互作中的相关重要基因及功能分析奠定基础。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

条斑紫菜孢子体cDNA文库构建及表达序列标签的初步分析

用λ噬菌体载体构建了条斑紫菜Porphyra yezoensis丝状体cDNA表达文库,并对文库进行了随机测序,对随机测序形成的719条表达序列标签(EST)序列进行了初步分析。结果表明:该文库包含1.52×106个独立克隆,重组率为88.2%;EST的冗余率为54.2%,新EST的比率为65.7%。本研究为开展条斑紫菜的功能基因克隆、分析和功能基因组学研究提供了条件。EST序列已递交Gen-Bank,编号为CX873884到CX874602。     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。     

表达序列标签(EST)分析及藻类EST文库的研究进展

随着生物信息学的发展,表达序列标签（EST）在基因组作图、克隆基因、新基因的识别、蛋白质组研究等方面具有重要作用。笔者简要介绍了EST技术的原理及其在构建遗传图谱、分离与鉴定新基因等方面的应用。综述了藻类EST文库的研究现状,并对EST的应用前景进行了展望。     

鮸鱼全长均一化cDNA文库的构建及EST序列信息学分析

采用双链特异性核酸酶(DSN)均一化技术与SMART技术相结合,以经过鳗弧菌感染后获得的娩鱼脾脏材料构建均一化全长cDNA文库.该原始文库约含有7.5×106个重组子,插入片段在1～3kb之间,文库滴度为1.6×106 CFU.mL-1.从文库中随机挑选5 952个克隆进行测序,共获得5 053条表达序列标签(EST),其中高质量序列4 609条.对序列进行组装后,发现非冗余基因序列3 221条,重叠群656个,单拷贝序列2 565条,冗余率为30.11％.对全部序列分析后发现,其平均读长为550 bp,大部分序列长度在500～599 bp之间,GC含量大部分分布于40％～60％之间.1 397个基因能够进行GO( gene ontology)功能注释,并初步筛选到大量与免疫功能相关的蛋白家族及功能域的基因序列,为进一步娩鱼分子育种奠定了基础.     

猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究

应用ＦＡＣＳ、ＭＴＴ法对猪瘟基因疫苗ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ免疫鼠外围血中ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋淋巴细胞数、淋巴细胞的转化功能等动态变化进行了观察。结果：ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ猪瘟基因疫苗免疫小鼠后,小鼠的外周血淋巴细胞对ＬＰＳ有强烈的反应性,ＣＤ４＾＋细胞数量增加,外周血淋巴细胞ＣＤ８＾＋细胞数量在一段时间内增加。ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋细胞数量在免疫后３２天达到高峰后开始下降。表明ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ质粒免疫小鼠后诱发免疫反应。     

Construction and Analysis of Suppression Subtractive cDNA Library from Fertile Disk Floret Buds of Zinnia elegans

In order to isolate genes related to anther development and understand molecular basis of male sterility,cDNA library of Zinnia elegans was constructed using suppression subtractive hybridization (SSH)...     

烤烟品种K326茎叶消减文库的构建及质量分析

利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建烤烟品种K326的茎叶抑制性消减cDNA文库.结果表明,文库的滴度为1.76×106cfu.mL-1,重组率为75%,随机扩增480个克隆,显示插入片段长度在200-1000 bp之间,符合建库的质量标准.     

Generation and Analysis of Expressed Sequence Tags （ESTs） from Muscle Full-Length cDNA Library of Wujin Pig

Porcine skeletal muscle genes play a major role in determining muscle growth and meat quality. Construction of a full-length cDNA library is an effective way to understand the expression of functional genes in muscle tissues. In addition, novel genes for further research could be identified in the library. In this study, we constructed a full-length cDNA library from porcine muscle tissue. The estimated average size of the cDNA inserts was 1 076 bp, and the cDNA fullness ratio was 86.2%. A total of 1 058 unique sequences with 342 contigs （32.3%） and 716 singleton （67.7%） expressed sequence tags （EST） were obtained by clustering and assembling. Meanwhile, 826 （78.1%） ESTs were categorized as known genes, and 232 （21.9%） ESTs were categorized as unknown genes. 65 novel porcine genes that exhibit no identity in the TIGR gene index of Sus scrofa and 124 full-length sequences with unknown functions were deposited in the dbEST division of GenBank （accession numbers： EU650784-EU650788, GE843306, GH228978-GH229100）. The abundantly expressed genes in porcine muscle tissue were related to muscle fiber development, energy metabolism and protein synthesis. Gene ontology analysis showed that sequences expressed in porcine muscle tissue contained a high percentage of binding activity, catalytic activity, structural molecule activity and motor activity, which involved mainly in metabolic, cellular and developmental process, distributed mainly in intracellular region. The sequence data generated in this study would provide valuable information for identifying porcine genes expressed in muscle tissue and help to advance the study on the structure and function of genes in pigs.     

CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的初步研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),设计了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,通过人工合成,分别作用于猪外周血淋巴细胞和脾细胞,进行健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激效果,其中CpG-ODN6、CpG-ODN7刺激强度极显著。为研制DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定基础。     

番茄长花柱品系T431低温胁迫下正向差减文库的构建及ESTs分析

本研究以番茄长花柱品系T431为材料利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了低温胁迫下的番茄长花柱突变体SSH cDNA正向差减文库,获得398个阳性克隆.经菌液PCR和Reverse Northern Blot杂交方法结合剔除假阳性,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对,获得有功能的ESTs 173个.通过对所获得的ESTs序列进行功能分类发现,其中参与初级代谢、能量代谢、抗病/防御反应和信号传导等过程的基因相对较多.此外,还有一些基因参与植物体内蛋白质合成与加工、物质运输、转运调控与生殖发育等过程.