应用多重SYBR Green-I实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒

基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量 PCR(real time-quantitative,RT-qPCR）检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重 SYBR Green-I实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.     

甘蔗黄叶病毒基因型研究进展

综述了世界甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)基因型的研究进展,研究表明,ScYLV为正单链RNA病毒,全基因组由5895～5899个核苷酸组成。目前基于ScYLV基因组核苷酸序列的对比可将ScYLV划分为7种基因型,其中BRA基因型为主要基因型。不同基因型的ScYLV存在致病性差异。     

抗原直接包被间接ELISA检测甘蔗黄叶病毒

利用正交设计L9(34)方法优化甘蔗黄叶病毒(SCYLV)抗原直接包被间接ELISA实验条件,统计结果表明,甘蔗蔗汁和蔗叶SCYLV粗提液包被抗原合适体积为150μL,最佳的抗体浓度SCYLV-IgG多克隆抗体(一抗)稀释1500倍,碱性磷酸酶羊抗兔IgG(二抗)稀释20000～30000倍,最佳反应时间为1～2h。应用这一优化体系,分析甘蔗不同部位的蔗茎和不同叶位的叶片SCYLV滴度的差异,结果表明,上部甘蔗蔗茎SCYLV病毒含量显著高于中下部蔗茎组织,最高可见肥厚带叶(+1叶)及其上一叶(-1叶)的嫩叶组织SCYLV病毒含量显著高于最高可见肥厚带叶以下第2叶(+3叶)和第4叶(+5叶)的老叶组织。甘蔗幼嫩组织部位SCYLV滴度较高,更适合于病毒检测。     

甘蔗黄叶综合症的RT—PCR检测初报

对2002年12月采自南宁的4个田间症状程度不同的样品作RT-PCR检测，结果表明，A1(粤糖93／159)、A2(粤糖93／159)、B1(CP88／1508)3个样品为阳性，确认田间发生的是甘蔗黄叶综合症(YLS)，是我国甘蔗新病害。建议尽快对病害加以控制，并加强甘蔗引用检疫工作。     

海南50个甘蔗品种黄叶病毒的分子鉴定

为明确国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种在海南省被甘蔗黄叶病毒(SCYLV)侵染情况及病毒基因型类型,从集成示范及区试的50个甘蔗品种上采集带有显著病症或不显病症样品50份,采用特异引物通过RT-PCR方法进行甘蔗黄叶病毒检测和病毒基因型鉴定。结果表明:50个甘蔗品种中有31个被检测到SCYLV,检出率为62%;病毒基因型有古巴(CUP)基因型、巴西-秘鲁(BAR-PER)基因型和留尼汪岛(REU)基因型3种,主要以CUP基因型为主,占58.06%,其次是BAR-PER基因型,占51.61%,REU基因型最少,占29.03%;未发现CHN1、CHN2、CHN3基因型。另外,不同基因型混合侵染现象普遍存在,总混合侵染率达32.26%。可见,海南国家甘蔗体系集成示范及区试甘蔗品种严重感染甘蔗黄叶病毒(SCYLV),且存在不同基因型混合侵染,建议推广种植脱毒种苗来控制甘蔗黄叶病的发生。本研究为在海南蔗区推广和种植甘蔗脱毒种苗及抗病育种提供了理论支持。      

甘蔗黄叶病毒的TBIA快速检测

利用从法国引进的甘蔗黄叶病毒(ScYLV)标准抗原抗体,研究建立了TBIA快速检测ScYLV的方法.通过对田间采集的样本进行检测,同时以DAS-ELISA检测法印证,检测结果一致,表明TBIA能简便、快速、准确、有效地检测出ScYLV,且检测效率高,适合于田间大批量样品快速检测.为甘蔗黄叶病的诊断和防治、脱毒种苗的生产、对外甘蔗品种/材料交换检疫检测提供了技术支撑.     

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。     

转甘蔗抗虫基因CpTI的RT-PCR检测

利用已修饰的CpTI基因进行转基因检测,根据修饰后的目的基因片段序列对两个甘蔗品种(P44和福农94-0403)的转基因甘蔗进行RT-PCK检测研究,结果在被检测的10 株甘蔗中验证了3株已转入植株中,RT-PCR检测到的20、25、26号植株均呈阳性,证明被修饰的sck基因已成功转入甘蔗.     

广西甘蔗新病害——甘蔗黄叶综合症

甘蔗黄叶综合症(YLS)是广西新发生的一种病毒性病害。本文简要介绍该病的症状和诊断方法，国外发生的概况及我区YLS的诊断结果，提出当前控制此病的意见。     

应用RT-PCR技术检测甜菜坏死黄脉病毒

为了更加准确地检测患有丛根病的甜莱植株中BNYVV病毒的含量。实验采用了RT-PCR的方法分别从26株待测甜菜的根中扩增获得了324bp的BNYVV病毒基因片断。通过调整反转录cDNA模板的浓度,研究发现,当cDNA模板稀释到100倍时．能更加精准地检测到不同丛根病染病植株中BNYVV病毒含量的差异。同时．半定量PCR的统计结果进一步表明．当待测植株中BNYVV病毒的相对含量低于阳性对照的一半时,甜菜丛根病病症并不明显;而当其相对含量超过阳性对照的1．3倍时,甜菜受害严重,有些几乎死亡。本检测方法为更加及时、快捷、准确和系统地检测甜菜植株的染病程度打下了良好的基础．     

国外甘蔗品种斐济病的RT-PCR检测

应用RT-PCR技术对国外引进的甘蔗品种(材料)进行了甘蔗斐济病的检测,进一步改进和完善了该检测技术。     

槟榔黄化病病原及检测方法研究进展

黄化病是一种严重威胁槟榔生产种植的毁灭性传染性病害,目前主要在印度和我国槟榔主产区发生。本文从非生物与生物因素两方面对槟榔黄化病病原认识过程及检测方法进行详细的综述。     

应用RT-PCR技术检测马铃薯A病毒

参考GenBank中马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)的保守序列,利用Primer6.0引物设计软件设计并合成了一对特异性引物PVAF、PVAR,以此引物利用RT-PCR方法对PVA保守序列基因进行了特异性扩增。结果表明:引物PVAF、PVAR能从已知的感染PVA病毒的植株中扩增出834bp的cDNA特异性片段;该RT-PCR的检测灵敏度为1pg的病毒核酸,特异性强,重复性好,可用于PVA病毒的快速检测。     

马铃薯Y病毒一步RT-PCR检测试剂盒的研制

马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)对马铃薯的危害最大,可导致马铃薯退化,降低马铃薯产量。解决这一问题的重要途径就是培养脱毒种薯,但是否完全脱毒需要经过检测才能证实。本研究依据PVY CP基因序列设计合成了一对引物PY1、PY2,以带毒样品植物总RNA为模板,在同一个反应中同时加入反转录和PCR反应所需试剂,反应程序中包括反转录和PCR反应所需条件,进行反应扩增,带毒样品扩增得到340 bp的目的条带,而健康对照无此目的条带,从而建立了PVY的一步RT-PCR检测技术,并组装成试剂盒。该试剂盒具有良好的稳定性和特异性,灵敏度可以检测到带毒植物组织下限的6.25μg,高于ELISA(100μg)和NASH(15μg)的灵敏度,虽然和常规方法的灵敏度相同,但更为快速、简便、易于操作,适合脱毒苗和脱毒种薯生产单位做大量样品的检测。     

大豆花叶病毒的组织印迹与RT-PCR检测

用改进的组织印迹方法批量检测黄淮地区69份SMV样品,结果显示42个标样呈现非常清晰的蓝紫色阳性反应,26个标样显色较弱而无法确证,1个标样呈阴性反应.进一步对图片进行600 dpi扫描并放大200倍进行分析,发现26个显色弱的标样中有25个呈阳性反应,1个标样显色很弱仍无法确证,使得检出率提高了37%.利用RT-PCR程序对随机选取的8个样品进行验证,发现纯化与未纯化的RNA模板均能得到较为清晰的扩增条带,而只有纯化后的PCR产物二次扩增才有预期的条带,且双酶切可产生245 bp、255 bp和307 bp 3个预期的片段.表明改进的组织印迹方法能够用于批量、高效地检测SMV,而RT-PCR可用于更为精确的检验.