曼氏无针乌贼荧光染色标志方法研究

建立一种高效的标志方法,为更加准确地评价曼氏无针乌贼增殖放流的效果提供技术保障.以曼氏无针乌贼为试验对象,利用茜素络合物(ALC)浸泡曼氏无针乌贼幼体,对其内壳进行标志.设置5个浓度梯度组和2个时间段,测量并观察曼氏无针乌贼胴背长、体质量及存活率.将试验组与对照组各50尾饲养于直径2.5m的圆形水泥池内,分别在染色后5、12、19、26 d进行随机取样并对标志曼氏无针乌贼进行高温处理5 min,解剖出内壳观察标志色保留状况.最佳染色剂浓度和浸染时间分别为90 mg/L和24 h;曼氏无针乌贼胴背长和体质量呈极显著正相关(P＜0.01),试验组与对照组曼氏无针乌贼的生长发育差异不显著(P＞0.05);26 d后内壳标志色依然清晰保留初染时的椭圆形粉红色,高温处理前、后着色部位的范围和颜色均未发生变化.ALC荧光染色标志法兼具体内标志和外部可见的双重效果,标志曼氏无针乌贼的存活率和标志色保持率均为100％.结果表明本方法简单高效,能进行批量标志处理,是一种理想的曼氏无针乌贼标志方法,具有广阔的应用前景.     

玻璃管动物标签标志曼氏无针乌贼幼体的效果初探

近年来,随着苗种繁育技术的突破,曼氏无针乌贼大规模增殖放流工作已在中国沿海迅速展开,但至今中国尚不能对增殖放流活动的实际效果进行准确评估,建立适于曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)的增殖放流标志方法是准确评估增殖放流效果的重要前提。本研究采用玻璃管动物标签法对曼氏无针乌贼幼体进行了标志,并对该标志的有效性、保持率及其对乌贼行为、生长及存活率的影响进行了评估。结果表明:将玻璃管动物标签植入内壳包膜后,可在乌贼幼体(胴长2.63～2.88 cm)背部标签所在位置形成明显的隆起,可直接通过肉眼或标签阅读器进行准确快速识别;室内养殖条件下,50 d后乌贼标志的保存率达100%;标志后乌贼行为活动正常,并仍保持较快的生长速度,50 d内即达到成体规格并达性成熟,其瞬时生长率达5.93%/d;标志乌贼的全长、胴长、胴宽、体重、壳长、壳宽和壳重等生长参数上均与对照组无显著差别(P0.05);标志乌贼实验期内的累计存活率达78.85%,与对照组相比无显著差别(P0.05)。研究认为,玻璃管动物标签是一种易识别、低损伤、保持率高的理想增殖标志,可有效运用于曼氏无针乌贼的大规模标志放流及增殖效果评估过程。本研究可为曼氏无针乌贼及其他头足类水产动物种质资源保护提供方法支持。     

金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析

为揭示金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征,本研究采集其红珠与黑珠期、心跳期、出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄6个时期的金乌贼,分别测量其胴腹长(DML)、胴宽(MB)、体重(BW)、壳长(CL)、壳宽(CB),壳重(CW)、生长纹数(LN)7项指标,进行内壳形态学的主成分分析.结果显示,红珠与黑珠期、出膜期和10日龄时期各生长指标间均呈显著性正相关,心跳期、初孵化幼体期和5日龄时期部分生长指标间相关性不显著.主成分分析显示,红珠与黑珠期、心跳期的第1主成分为质量因子(体重和壳重),出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄等4个时期的第1主成分为长度因子(胴腹长和壳长),这表明金乌贼不同时期内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异,出膜前(红珠与黑珠期和心跳期)质量因子的增长优于长度因子的增长,而出膜后(出膜期至10日龄时期)长度因子的增长优于质量因子的增长.     

方斑东风螺规模化苗种繁育技术研究

利用从自然海区诱捕的4307个方斑东风螺为亲螺,在体积分别为22 m3和45 m3的室内水泥池以及体积为18m3的室外水泥池(水体总体积为4218 m3)中共获得变态2～4 d的稚螺3785.4万粒,培育出变态稚螺8975粒/m3.收集刚变态稚螺于未铺设砂层的育苗池内暂养9～12 d,暂养后存活稚螺共计2281.8万粒.暂养平均成活率60.3%.暂养后稚螺再放养于铺有约3 cm细砂层的水泥池中进行苗种培育41～88 d,共培育出壳高0.6～1.8 cm的螺苗1318.3万粒,暂养后稚螺培育成螺苗成活率57.8%;从变态2～4 d稚螺培育成螺苗的成活率34.6%.     

金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳形态学指标的主成分分析

为揭示金乌贼(Sepia esculenta)早期发育阶段内壳生长发育规律和形态学特征,本研究采集其红珠与黑珠期、心跳期、出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄6个时期的金乌贼,分别测量其胴腹长(DML)、胴宽(MB)、体重(BW)、壳长(CL)、壳宽(CB),壳重(CW)、生长纹数(LN)7项指标,进行内壳形态学的主成分分析。结果显示,红珠与黑珠期、出膜期和10日龄时期各生长指标间均呈显著性正相关,心跳期、初孵化幼体期和5日龄时期部分生长指标间相关性不显著。主成分分析显示,红珠与黑珠期、心跳期的第1主成分为质量因子(体重和壳重),出膜期、初孵化幼体、5日龄、10日龄等4个时期的第1主成分为长度因子(胴腹长和壳长),这表明金乌贼不同时期内壳形态学各性状的生长速率存在一定差异,出膜前(红珠与黑珠期和心跳期)质量因子的增长优于长度因子的增长,而出膜后(出膜期至10日龄时期)长度因子的增长优于质量因子的增长。     

饵料、盐度对金乌贼幼体生长的影响

针对金乌贼（Sepia esculenta Hoyle）幼体培育困难的技术问题,以不同的饵料组合投喂金乌贼幼体。试验结果显示,卤虫幼体、配合饲料、糠虾、小虾、冰鲜鱼虾饵料组能满足其正常生长营养需求,60d成活率可达67％。通过金乌贼幼体在不同盐度水体培育下成活率的测定,确定其可在盐度24～37的水域正常存活。     

茜素络合物对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)苗种耳石的染色标记效果

采用茜素络合物(Alizarin Complexone,ALC)分别浸泡标记70 d和170 d半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)苗种耳石,设置了5个浓度组和3个时间梯度组.结果显示,ALC对半滑舌鳎70-170 d苗种的耳石染色效果明显.综合考虑存活率和标记效果,ALC浸泡标记半滑舌鳎苗种耳石的适宜浓度为100 mg/L (36 h浸泡处理)和150 mg/L(24 h浸泡处理).相同浸泡时间下,随着ALC浓度的增加,耳石上标记信号强度增加,但实验鱼死亡率升高;相同浸泡浓度下,随着时间的增加,耳石上标记信号强度增加,实验鱼死亡率也会升高.对标记的170d苗种进行养殖实验,每30 d取样矢耳石进行观察,发现4个月后实验鱼生长良好,且耳石荧光信号仍可清晰检测到,表明ALC在半滑舌鳎矢耳石上形成的荧光标记可长期存续,标记效果好.研究结果可为半滑舌鳎大规模标志放流及早期生活史研究提供群体身份识别技术支持.     

金乌贼幼体弧菌性坏死病的病原、组织病理特征和药物敏感性

对青岛市黄岛区人工繁育金乌贼(Sepia esculenta)苗种大规模坏死病进行了病原、组织病理、传播途径和防控药物研究。发病金乌贼幼体不摄食,生长缓慢,体色发黑;体表、肌肉、口腕、触腕及内脏团大面积溃烂,死亡率高达90%;组织病理学显示:患病金乌贼皮肤色素细胞崩解,肌丝断裂,鳃丝崩解,肝细胞大量坏死脱落,肠道微绒毛脱落;从患病金乌贼分离出3株优势菌(SE-A、SE-B和SE-C),人工感染实验表明,SE-B、SE-C对金乌贼半数致死量分别为3.98×10~6 CFU/mL和8.91×10~5 CFU/mL,有较强致病力,为该病的致病菌;根据细菌形态、生理生化和16S rDNA序列分析将SE-B和SE-C鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。分析金乌贼幼体、育苗用水和生物饵料糠虾的病原菌来源、分布和优势度,发现致病菌主要由糠虾携带进入育苗系统。分析了2株致病菌的药物敏感性,SE-B对强力霉素和氟苯尼考等敏感,对链霉素、庆大霉素等耐药;SE-C对氟苯尼考和罗美沙星等敏感,对新霉素和克拉霉素等耐药。     

河北池塘养殖罗氏沼虾技术操作要点

<正> 5 成虾池的管理 虾苗移入水泥池、网箱或土池内暂养一段时间后,其个体达到1.5cm以上,养成池清塘后10～15d,经试放苗后即可转入养成池。放苗时应在池塘的上风头,轻轻将苗放入池中。     

斑点叉尾鮰苗种培育

1幼苗暂养刚孵化出膜的斑点叉尾鮰幼苗,卵黄囊较大,不能自由游泳,喜欢聚集在水体的底部,要进行暂养,待鱼苗不断发育,将卵黄囊吸收后能自由游动时,才能进入鱼苗池中培育。1.1水泥池暂养水泥池1~3m2,采用流水培育,将带卵黄的幼苗放入水泥池中,每立方米水体放2万~3万尾,开始3~4d,不断流水,保持充足的溶氧即可,4~5d后鱼苗能自由游动时,开始投喂浮游动物(如水蚤、活体与冰冻均可)或人工配合微型饲料,以浮游生物为佳。7~10日龄,幼苗体色从微红变为深灰色,即可出售或下塘培育。在暂养过程中,要保持充足氧气,并清除水泥池中的杂物及粪便。1.2网箱暂…     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

倒刺鲃属三个种之间种间杂交的初步研究

采用人工催产和干法授精技术,进行了以中华倒刺鲃、倒刺鲃为母本与其父本及黑脊倒刺鲃雄鱼的种间杂交实验,获得4个杂交组合和2个自交组合,在(27±0.5)℃温度条件下,对其F₁卵膜径、受精率、孵化率、孵化时间、畸形率、子代早期形态特征与成活率进行了比较,同时,观察了胚胎发育及其异常现象,结果表明:以中华倒刺鲃为母本的F₁卵膜径差异不显著;以倒刺鲃为母本的F₁卵膜径,在多细胞期时差异不显著,在耳石期时,倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁卵膜径显著大于母本(P<0.05)。杂种F₁的受精率、孵化时间与母本差异不显著,畸形率显著高于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁的孵化率较高,与母本差异不显著(P<0.05)。倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁的孵化率与母本之间差异不显著,倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂F₁的孵化率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁仔鱼早期发育阶段存在死亡高峰期,成活率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃种间杂交和倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂杂种F₁既具有父本特征,同时又具有母本特征,初步证明倒刺鲃属种间杂交是可行的。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.     

青鱼和鲇肠道排泄物对养殖水体铜绿微囊藻休眠体复苏的影响及作用途径

为探讨养殖水体底栖鱼类肠道排泄物对铜绿微囊藻休眠体复苏的影响,将青鱼和鲇肠道排泄物与铜绿微囊藻休眠体用野外养殖水域沉积物(底泥)混匀包埋,在10、15和20°C梯度温度下进行休眠体复苏实验.结果显示,铜绿微囊藻休眠体主要复苏期为第3～15天,在10和15°C条件下,青鱼排泄物组(MP)、鲇排泄物组(SA)和青鱼-鲇排泄...     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

CYP3A65及上游核受体基因PXR和AHR2在斑马鱼生长发育阶段的表达

为了选择处于最佳生长阶段的斑马鱼用于药物代谢研究,本实验考察不同生长阶段斑马鱼全鱼、肝脏和肠道组织中CYP3A65及其上游核受体基因(PXR、AHR2) mRNA表达水平的变化规律。实验测定CYP3A65、PXR和AHR2相对表达量,并通过比较核受体基因与代谢酶基因mRNA之间的相关性来证实核受体基因的调控作用。结果显示,144 hpf和75 dpf两个生长阶段的斑马鱼中CYP3A65、PXR和AHR2 mRNA表达量最高;斑马鱼生长阶段中代谢酶基因和核受体基因的表达趋势一致,且受肝脏、肠道组织占全鱼比重的影响。研究表明,幼鱼期144 hpf斑马鱼及稚鱼期75 dpf的斑马鱼最适用于CYP3A65代谢研究;CYP3A65与PXR、CYP3A65与AHR2的mRNA表达之间有显著的相关性,与AHR2的相关性更显著。     

Movement of the fluvial form of masu salmon, <Emphasis Type="Italic">Oncorhynchus masou masou</Emphasis>, in a mountain stream in Kyushu,Japan

Using mark-recapture methods, the movements of the fluvial form of masu salmon (Oncorhynchus masou masou) in a mountain stream on the island of Kyushu, Japan, were studied. Most (78%) of the masu salmon were recaptured in the pool in which they had been originally caught and tagged. Of those that moved between pools, the proportion of individuals that moved during the breeding period was not significantly higher than the proportion that moved during the non-breeding period. However, during the breeding period, a higher proportion of larger salmon moved than did smaller fish. The proportion of mobile large males during breeding period was higher than that for small males. Also, it was found that a few individuals showed long-range movement in the autumn. As a long-term movement, 78 individual fish (65%) that were recaptured more than three times showed high sedentary tendencies. Sixteen individual mobile fish (13%) moved and returned to the original pool. Fluvial form of masu salmon in Kyushu show a high sedentary nature; however, large mature males seem to actively move in search of female during breeding period.