猪CAⅢ基因CDS区克隆、生物信息学及组织表达分析

对猪碳酸酐酶Ⅲ(Carbonic anhydraseⅢ,CAⅢ)基因进行克隆及生物信息学分析,并分析该基因的时空表达特性。通过RT-PCR和克隆测序技术获得猪CAⅢ基因的CDS序列,综合利用多种生物信息学软件,对该基因编码的蛋白质生物学特性进行预测,采用qRT-PCR技术检测CAⅢ基因的组织表达谱和时序表达规律。结果表明,猪CAⅢ基因CDS区长783 bp,编码260个氨基酸;CAⅢ蛋白为亲水性碱性蛋白,无信号肽,主要在细胞质中发挥作用;CAⅢ基因在心脏、肝脏、胰脏、肺、胃、背最长肌、皮下脂肪、脾脏、盲肠等9种组织中均有表达,但在背最长肌中表达量最高,极显著地高于其他组织。从初生到5月龄,大白猪背最长肌中CAⅢ基因 mRNA表达量呈上升—下降—上升—下降的趋势,初生时最低,随后表达量逐渐升高,到3月龄时达到峰值,之后开始下降;马身猪中,从初生到5月龄,CAⅢ基因 mRNA的表达量基本呈上升趋势,在5月龄时达到峰值,极显著地高于其他各个阶段。2个不同品种相比,3月龄和4月龄时,大白猪CAⅢ mRNA表达量显著或极显著地高于马身猪;而在5月龄时,马身猪CAⅢ mRNA表达量极显著地高于大白猪,其他阶段2个品种CAⅢ mRNA表达量无显著差异。CAⅢ基因可能直接或间接参与猪骨骼肌的生长发育过程。     

猪Mighty基因的克隆与组织表达分析

Mighty基因是在骨骼肌中发现的一个新颖的肌形成前期因子。基于电子延伸序列,本试验成功克隆出了Mighty基因,其全长874 bp,开放阅读框为579 bp,编码有193个氨基酸,提交GenBank(EU559709)。同时,试验采取半定量RT-PCR法,以18S rRNA为内标,研究了Mighty基因在仔猪18个组织中的分布和mRNA的表达水平。     

撒坝猪MCUR1基因克隆、生物信息学分析及其组织表达量检测

本研究克隆了撒坝猪MCUR1基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在撒坝猪、大白猪不同组织中的表达水平。根据GenBank上公布的猪的MCUR1基因序列(登录号:XM_003128183.4)设计引物,通过PCR扩增及测序获得撒坝猪MCUR1基因CDS序列,该序列全长1 095 bp,编码364个氨基酸;MCUR1蛋白的分子式C₁₇₈₇H₂₉₄₉N₅₃₃O₅₀₃S₁₄,相对分子质量40.398 ku,理论等电点(pI)10.27,不稳定系数55.70,脂肪指数95.99,平均亲水性为-0.213,属于亲水蛋白;MCUR1蛋白没有信号肽和跨膜结构,含有2个螺旋卷曲结构,主要在细胞质中发挥生物学功能;含有32个磷酸化位点;含有一个CpG island;二级结构由58.24%的α-螺旋,4.12%的β-转角,30.22%的无规则卷曲,7.42%的延伸链构成;猪MCUR1基因编码区序列与牛、鸡、狗、山羊、人、猴、鼠、绵羊的同源性分别为85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%,与绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近,与鸡的关系较远;在肝脏中的表达量最多,肺脏中的表达量最少。在大白猪的背最长肌中MCUR1的表达量高于撒坝猪的背最长肌(P<0.01)。     

猪GPR40基因的生物信息学分析

克隆猪GPR40(G protein-coupled receptor)基因,并对其生物信息学进行分析。结果表明,克隆的该基因(GenBank登陆号为EU366318)与已发表的人、大鼠和小鼠GPR40基因核苷酸序列同源性分别为85%、80%和82%,氨基酸序列同源性依次为86%、82%和83%,其编码的蛋白质分子量为22.59 ku,等电点(pI)9.54,包含215个氨基酸残基,有许多内切酶位点;结构分析发现,该基因无信号肽,但包含一个7次跨膜结构,其蛋白产物多集中在细胞膜上。表明该蛋白结合在细胞膜上作为许多信号分子受体,参与体内脂类代谢等。     

猪TDRP1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用生物信息学和比较基因组学方法,对猪TDRP1基因的结构、表达及功能进行分析,结果表明:(1)电子克隆获得猪TDRP1基因cDNA部分序列共776bp,包括119bp的5′UTR、561bp的编码区和96bp的3′UTR,共编码合成187个氨基酸多肽;(2)猪TDRP1基因CDS序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为85%、76.1%、77.1%.编码合成的猪TDRP1蛋白与人、小鼠、大鼠之间的同源性分别为82.5%、71.1%和70.1%;(3)猪TDRP1蛋白的相对分子质量为20489.8,不含信号肽,为1个可溶性蛋白,同时也是1个非分泌性蛋白,存在4个二级结构区段;(4)基于cDNA及EST数据库的检索显示,猪TDRP1基因至少在卵巢和甲状腺等组织中表达.     

蚕豆耐盐相关基因VfHKT1;1的克隆、生物信息学分析及表达特性

高亲和性钾离子转运蛋白(high affinity K+transporter,HKT)能够调节细胞及整株的Na+/K+转运,在植物盐胁迫调控中发挥着重要作用.采用RT-PCR和PCR方法克隆获得蚕豆VfHKT1;1基因全长编码序列,该基因包含1659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸.系统进化树分析发现,该蛋白属...     

版纳微型猪近交系FANK1基因CDS克隆、qPCR表达及功能生物信息学分析

【目的】获得猪FANK1基因CDS序列、组织表达和蛋白质功能信息。【方法】以GenBank下载的猪及近缘物种的FANK1 mRNA序列为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)睾丸组织中扩增FANK1基因完全编码序列及部分侧翼序列。应用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的FANK1 mRNA转录表达水平,并对FANK1翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测FANK1蛋白质的功能,最后构建FANK1多物种氨基酸系统进化树。【结果】获得了BMI FANK1编码区序列长1 041 bp,编码346个氨基酸,序列已提交GenBank,基因登录号为KU705617和KU705618,对应的氨基酸登录号为AOC89035和AOC89036。基因组结构分析表明FANK1基因定位于猪14号染色体,有11个外显子和10个内含子。多组织相对荧光定量表达分析表明FANK1基因在睾丸、尿道球腺和精囊腺中呈高表达水平;在其他组织中呈中低表达水平。功能生物信息学分析表明FANK1蛋白质含有2种保守结构域FN3和ANK,无跨膜螺旋结构,无N端信号肽序列,二级结构以无规卷曲为主,N末端和C末端均亲水,有4类功能活性位点。系统进化分析表明,FANK1基因在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近,符合物种的系统分类学。【结论】成功克隆了版纳微型猪近交系FANK1基因的CDS序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究FANK1基因在小型猪精细胞分裂及调节信号通路方面的作用及功能奠定基础。     

鲤RNF2基因的克隆、组织表达与生物信息学分析

以鲤肾脏组织RNA为模板,扩增并克隆鲤环指蛋白2(RING Finger Protein 2,RNF2)基因的CDS区全长,分析其组织表达谱.结果显示,鲤RNF2基因的CDS区序列长1011 bp,编码336个氨基酸;该基因与鲫、斑马鱼、金头鲷、海洋青鳉鱼、鳕鱼、非洲爪蟾、尖尾娇鹟、小鼠、智人的同源性分别为98.2％、...     

西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆西瓜半胱氨酸蛋白酶基因CICP2,并对其进行生物信息学分析。[方法]以西瓜花蕾cDNA为模板,借助西瓜全基因组数据库,采用RT—PCR方法对西瓜半胱氨酸蛋白酶基因进行克隆并进行生物信息学分析。[结果]克隆得到一个开放阅读框长度为960bp的序列,命名为C1CP1。该基因编码3t9个氨基酸。C1CP1基因的保守结构域分析结果表明,CICP1属于木瓜蛋白酶家族基因,与已知其他植物半胱氨酸蛋白酶在氨基酸序列上有56％～85％的相似性。聚类分析结果显示,C1CP1与同为葫芦科的黄瓜cP基因亲缘关系较近。[结论]CICP1属于西瓜木瓜蛋白酶家族新基因,为进一步研究西瓜半胱氨酸蛋白酶基因C1CP1的表达和功能奠定了基础。     

‘合作猪’TDRP1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】丰富猪TDRP1基因研究的基础数据.【方法】以猪NM_001198925序列为参考,设计特异性引物,通过克隆测序获得‘合作猪’TDRP1基因完整CDS序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测TDRP1基因在不同组织中的表达特性.【结果】获得了TDRP1基因完整的CDS序列(GenBank登录号:KU743254),共684bp,其编码186个氨基酸多肽.与参考序列相比,在编码区第33、348位点处发生了同义突变(C→G、C→T).TDRP1基因分子式为C_(897)H_(1421)N_(259)O_(287)S_2,理论等电点(PI)为5.86,不稳定系数为62.66,疏水指数为64.03,平均亲水性为-0.939,属不稳定可溶性酸性蛋白质.二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,属混合类蛋白质.亚细胞定位结果显示,TDRP1编码的蛋白质在遗传物质复制和转录、翻译过程中发挥功能的可能性分别为26.3%、14.3%,明显高于发挥其它功能的可能性.mRNA表达分析表明,TDRP1基因在垂体和睾丸中高表达,肺、肾、小脑、卵巢中度表达,肝、脾、大脑、胃、小肠中低表达,心脏组织中不表达.【结论】成功克隆了‘合作猪’TDRP1基因的完整CDS区序列,并发现了2个SNP位点;多组织转录表达分析表明TDRP1在垂体和睾丸中表达较高,可为深入研究TDRP1基因的功能提供参考.     

猪博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息学分析

根据Gen Bank发表的猪博卡病毒主要抗原基因NP1基因设计1对引物,采用降落PCR方法进行扩增,克隆后测序,并对该基因进行生物信息学分析。结果表明:成功克隆到猪博卡病毒NP1基因;NP1蛋白的二级结构中自由卷曲含量最高(51.77%),无跨膜蛋白,含有1个糖基化位点、30个磷酸化位点,有6个线性B细胞优势抗原表位,分别位于NP1蛋白的7—14位、27—50位、59—73位、85—94位、102—108位、151—155位。     

盐穗木Hc2a1基因的克隆及与表达分析

[目的]盐胁迫能够抑制植物生长.探讨盐穗木(Halostachys caspica)盐胁迫响应基因表达变化的影响,有助于阐明盐穗木的耐盐分子机理.[方法]利用RACE方法获得盐穗木Hc2a1基因全长序列,并进行生物信息学分析和基因表达检测.[结果]Hc2a1基因开放阅读框为2 277 bp,编码758个氨基酸,蛋白质分子量为87.29 KDa,理论等电点(pI)为9.32.亚细胞定位于线粒体内膜,具有一个16个氨基酸的信号肽,含多个跨膜结构域,亲水性氨基酸残基多于疏水性氨基酸残基,二级结构多为无规则卷曲.利用荧光定量PCR检测显示,在高盐浓度600 mmol/L处理不同时间条件下,随着盐胁迫时间的延长,Hc2a1的表达量逐渐上升,12h达到最高峰,随后开始下降.[结论]盐穗木Hc2a1基因编码多个C2结构域和跨膜区的蛋白质,基因表达受盐胁迫的诱导.     

牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据,对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA,并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列（GenBank登录号：DV874786.1）,使用Primer3.0在线软件设计特异性引物,运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树;利用PyMol软件修饰并输出三维结构;使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位;使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS区573 bp(GenBank登录号：KF669898),碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变,同源性为99.3%,这个突变未导致氨基酸序列的改变,4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7,分子量约为21.5 kD,理论等电点（pI）为6.32,消光系数为24075,不稳定系数为48.43,疏水指数为83.63,平均亲水性为-0.301,属不稳定可溶性酸性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,其中α-螺旋占64.21%,无规卷曲占35.79%,属全α类蛋白质。三级结构是一个呈“three-over-three”三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中,主要在细胞质,推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致,说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区,并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析,得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质,在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。     

大麦MBF1基因的电子克隆与生物信息学分析

通过同源比对,对大麦MBF1s基因进行了电子克隆,并通过生物信息学的方法对其及编码蛋白质进行了预测和分析.结果表明,克隆到大麦MBF1家族3个成员HvMBF1a、HvMBF1b和HvMBF1c,三者所编码蛋白质均包含典型的MBF1和HLH结构域,无可识别的信号肽和跨膜区,均为亲水性蛋白,含有数个可能的磷酸化位点.电子表达谱结果表明,3个成员在大麦的大部分组织器官中都有表达,而HvMBF1a和HvMBF1b对所分析的胁迫处理响应不明显,HvMBF1c的表达受各种处理的剧烈诱导,HvMBF1c可以作为大麦和其他作物抗逆性分子育种的重要候选基因.     

禹白芷苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 的克隆与表达分析

【目的】探究禹白芷中欧前胡素含量与苯丙氨酸解氨酶基因 AdPAL1 表达的相关性,并对 AdPAL1进行克隆和原核表达。【方法】使用高效液相色谱法测定禹白芷快速生长期和收获期根和叶中欧前胡素的含量,并使用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）方法测定 AdPAL1 基因在同时期根和叶中的表达情况,以观察欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达是否具有相关性。此外,以禹白芷转录组为基础,采用逆转录 PCR（RT-PCR）技术从禹白芷根中克隆 AdPAL1 基因,并在大肠杆菌中进行表达。【结果】禹白芷快速生长期根中的欧前胡素含量远高于叶,而 AdPAL1 基因在根中的表达量也远高于叶。与快速生长期相比,收获期根中欧前胡素含量略有下降,AdPAL1 基因在根中的表达量也同时下降。这些结果表明 AdPAL1 基因表达与欧前胡素含量具有相关性。此外,生物信息学分析显示,禹白芷 AdPAL1 基因（GenBank 登录号：OQ822236）开放阅读框长 1 764 bp,编码 557 个氨基酸,其蛋白相对分子质量为 61.10 kD,等电点为 5.92,且具有苯丙氨酸解氨酶保守结构域（IPR005922,1~547）,属于 PAL 蛋白家族成员。AdPAL1 蛋白定位于细胞质,主要由 α- 螺旋和无规则卷曲构成,与石防风属植物 KpPAL2 蛋白亲缘关系最近,序列相似性高达 99.28%。AdPAL1 基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为 84.00 kD,与预期蛋白大小一致。【结论】初步确定禹白芷根和叶中欧前胡素含量与 AdPAL1 基因表达相关,并成功克隆 AdPAL1 基因,在大肠杆菌中成功表达。上述结果为进一步研究 AdPAL1 基因在欧前胡素生物合成中的作用机制提供参考。     

鹅Mel 1c基因的克隆及生物信息学分析

从鹅脑组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增Mel 1c基因c DNA序列。结果表明,Mel 1c基因序列长为1 118 bp;与已报道其他物种的Mel 1c同源性为58.4%~72.2%;氨基酸序列的同源性为74.7%~97.0%;该基因编码的蛋白质为N端在胞内的六次跨膜蛋白,含有信号肽的分泌蛋白,N端亦含有两个糖基化位点;该蛋白也含有G蛋白偶联受体家族的结构域。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

木耳emg1基因克隆与生物信息学分析

以毛木耳和皱木耳的cDNA序列为模板设计简并引物并进行扩增,获得1条长度为1075 bp的序列Aa-2；与JGI数据库中皱木耳基因组Blastn比对E值为0；与编码emg1的氨基酸序列Blastx同源性比对的E值高达1.82e-112.与木耳全基因组序列中注释为emg1的核酸序列有775 bp的序列完全一致.经GenBank数据库Blastn同源比对,与玉米丝黑穗菌emg1蛋白cDNA的部分序列相似性达91％.经GenBank中Conserved domains搜索,Aa-2序列与emg1蛋白超家族序列同源比对的E值达2.66e-43,初步判定Aa-2的部分序列为emg1蛋白的编码序列.     

猪肌生成抑制素下游编码基因的合成及其克隆

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成12个单链片段，F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2和R1，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。Fl长38bp，R1长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NCoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDI8-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。     

人参达玛烷二醇合成酶基因的克隆、序列特征和组织表达分析

以五年生人参根组织为试验材料,利用RT-PCR方法克隆人参DS基因序列;通过生物信息学技术对其核苷酸序列和氨基酸序列进行比对;运用实时荧光定量PCR技术检测DS基因在人参根、茎、叶、果各部位的表达量。结果表明:获得人参DS基因c DNA全长,其核苷酸序列长为2.385 kb,含有1个开放阅读框,编码769个氨基酸多肽。生物信息学分析显示DS编码蛋白质包含1个跨膜区域,具有3个保守结构域。人参DS编码蛋白质与西洋参的DS(AGK62449)和三七的DS(AGI19258)具有99%的序列相似性。实时荧光定量PCR显示,DS基因在人参根、茎、叶、果各部位均有表达,在叶中表达量最高,其次是在果中,在根和茎中表达量相近。