PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）的双重纳米PCR（nano-dPCR）方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。     

专家试图解开PCV2和PMWS之迷

研究人员正伤透了脑筋,因为与猪圆环病毒(PCV2)有关的疾病(下称"PCV2有关疾病")一直困扰着全美国的商品肉猪生产者.     

有无PMWS病史比利时猪场中与PCV2有关消瘦的流行

本研究在3个有断奶后多系统消耗综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）病史的比利时猪场和4个无疑似PMWS对照猪场中确定了PMWS感染猪的流行情况。PMWS的诊断基于完成如下4个准则：呈现消瘦；PMWS的肉眼和组织病理学病变：在淋巴器官内有多量猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）。在有PMWS病史的猪场中，观察期间有2％仔猪死于PMWS。在对照猪场中，0．1％的仔猪感染PMWS。     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

为了解西宁市部分地区猪群中猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的感染状况。应用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对采自西宁市3个县6个规模猪场的365份血清样品进行PCV2抗体检测,并运用荧光定量PCR技术同步进行PCV2核酸检测。结果显示:PCV2抗体检测的平均阳性率为71.23%,猪场PCV2抗体阳性率最高达95.83%。荧光定量PCR对样品进行病原检测,阳性率达49.94%,此次调查反映了西宁市部分地区PCV2的感染情况,为西宁市PCV2的防控工作提供理论依据和指导。     

猪圆环病毒2型福建分离株ORF2基因遗传变异分析

为了解福建部分地区感染猪圆环病毒2型(PCV2)的基因型及遗传变异情况,采集了9份来自福建4个地区临床疑似PMWS仔猪肺、肾、淋巴结组织,病毒核酸提取后用PCV2ORF2特异引物进行PCR扩增、凝胶电泳,鉴定5份阳性样品,阳性率55.6%,回收、纯化阳性条带后送生物公司测序。Base by Base软件分析发现5份阳性样品ORF2的变异程度很小,主要是1~7个碱基点突变,有1处2个碱基连续突变,没有插入或缺失突变,同源性为98.91%~99.84%。进化树分析显示5份阳性样品都属于Group 1群(PCV2b型)中的1A/1B亚型,表明来自不同地区的样品之间变异较小。结合GenBank中已收录的所有福建18株PCV2ORF2序列进行分析,发现PCV2b基因型占95.6%,其中1A/1B亚型占72.7%,1C亚型占27.3%,结果表明PCV2b基因型中的1A/1B亚型在福建地区广泛流行并占主导地位。研究结果对本地区选择相匹配的疫苗进行有效防控具有重要意义。     

广东省4株PCV2型分离株全基因组进化分析

【目的】了解目前广东省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)分离株的基因型和进化特征,为广东省PCV2防控及疫苗株的筛选提供参考依据。【方法】运用PCR方法将4份鉴定为PCV2阳性样品进行PCV2全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析;利用MegAlign软件对4株PCV2广东分离株ORF2氨基酸序列与国内外参考毒株进行关键位点氨基酸变异分析;应用DNAStar中Protean软件的Jameson-Wolf方法对4株PCV2广东分离株ORF2基因编码的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数预测分析。【结果】测序结果表明,4株PCV2广东分离株序列长度均为1 767 bp。遗传进化树结果表明,4株分离株均属于PCV2d基因型,且核苷酸相似性在97.7%～99.1%之间,与国内外54株参考毒株相似性在91.7%～99.8%之间,其中与PhuTho/G40312/2018株(Viet Nam,登录号：LC602996)、QZ1410株(江苏,登录号：MG732832)、GXBB1501211株(广西,登录号：MH756609)亲缘关系最为接近。关键氨基酸位点...     

嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护

应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒（PCV1—2）及真核表达质粒pcDNA3．1／V5-His-ORF2作为免疫原免疫母源抗体ELISA效价在0．07～0．60不等的商品猪,9头猪随机分为4组,1组（3头）肌肉注射免疫10^3.5 TCID50的PCV1-2／头,2组（2头）肌肉注射真核表达质粒200μg／头,3组（2头）肌肉注射空载体（pcDNA3．1）200μg／头,4组（2头）不免疫作为攻毒对照组。于免疫后42d,PCV1—2组及真核表达质粒组产生了PCV2抗体。免疫后42d所有组攻毒PCV2和PRRSV,剂量分别为2×10^4.5 TCID50／头和10^6 TCID50／头。攻毒后21d,攻毒对照组猪淋巴结比免疫组显著肿大,免疫组猪血清、淋巴结中PCV2病毒栽量低于对照组,攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组。这些结果表明,嵌合型PCV1-2及真核表达质粒肌肉注射免疫商品猪后,对PCV2感染能产生保护性免疫应答,有可能成为候选疫苗。     

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10~(-8)μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。     

四川地区一株PCV2的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猪圆环病毒2型（PCV2）当前流行分离株的基因型和进化特征,本研究对PCV2阳性临床样品进行分离鉴定,并对分离毒株进行全基因组序列扩增、测序及遗传进化分析,利用MegAlign7.0和DNAstar软件对分离株ORF2基因编码的Cap蛋白进行氨基酸变异分析和抗原指数预测分析。测序结果显示,PCV2分离株（SMU-2022）的全基因组序列长度为1 767 nt。全基因组和Cap蛋白的遗传进化树结果均显示分离株属于PCV2d基因型,与国内外46株参考毒株的相似性在91.8%～99.1%之间,其中与QZ1410毒株的相似性最高,亲缘关系最接近。关键氨基酸位点变异分析表明,在Cap蛋白上有2个氨基酸特异性突变位点,分别是V30L和T232K。抗原指数分析发现,分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株相比差异较大,主要集中在第20-30、40-75、90-100、130-140、195-205、210-220位氨基酸这6个区域。     

2013~2017年江西省猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为掌握江西地区猪圆环病毒2型（PCV2）的分子流行病学及其遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2017年采集自江西省南昌市、宜春市、新余市、赣州市、吉安市、九江市、上饶市、抚州市、景德镇市、鹰潭市等10个地区的1 082份疑似PCV2感染猪病料组织进行病原学检测,并通过PCR扩增、克隆和基因测序对PCV2的全基因组序列进行分析。研究表明,1 082份病料中有610份为PCV2阳性,总阳性率为56.4%,其中2013~2017年阳性率分别为52.7%、48.8%、58.5%、71.0%和67.4%。共获得89株PCV2全基因组序列,其中有83株为PCV2b基因型,其中53株归类于PCV2b-1C基因亚群,30株归为PCV2b-1A/1B基因亚群;6株为PCV2a型。测序毒株与参考毒株ORF2基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.9%~100.0%和86.0%~100.0%;氨基酸序列分析表明,Cap蛋白存在20个氨基酸突变位点。本研究表明,江西地区猪群中PCV2的主导基因型为PCV2b,其中又以PCV2b-1C基因亚群占据主导地位,同时也存在少量PCV2a基因型。     

陕西7个地区猪2型圆环病毒(PCV2)感染的血清学调查

为明确陕西省PCV 2感染的发生情况,以便控制PMW S的流行,本试验用间接EL ISA方法对陕西省7个不同地区多个猪场不同日龄的猪群进行了PCV 2感染的血清学调查。报告如下。1材料与方法1.1材料被检血清样品共476份,采自陕西省榆林、宝鸡、西安、渭南、汉中、商洛、安康等7个不同地区     

猪圆环病毒（PCV2）综述之一—由来与相关猪病

猪断奶后衰竭综合征(PMWS)的主要病原体,已被世界各国学者确认为圆环病毒(PCV2)。本病最早发现于加拿大(1991),1996年暴发该病,同时此病很快在美国、西班牙、英国、丹麦、德国、荷兰、比利时、立陶宛、奥地利和意大利发生。除上述国家外,近年来,日本、韩国、泰国、捷克、墨西哥、匈牙利、中国以及台湾地区均有此病发生和流行,另外PCV2与许多猪相关疾病的发生有关。除PMWS之外,PDNS(猪皮炎与肾炎综合征)、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。     

猪圆环病毒3型感染的流行情况与检测方法研究进展

猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)是猪群中流行的一种新型猪圆环病毒。2016—2017年,世界范围陆续报道在猪群中发现PCV3,包括美国、中国、美国、韩国、巴西、波兰和意大利等。PCV3感染多见于具有皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状的猪群,目前病毒尚未分离成功。本文综述了已报道的PCV3在世界范围内的流行情况,介绍了当前研究的PCV3分子和血清学诊断方法。     

近十年来PCV2在英国的流行情况

10年前,仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Post-Weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)首次露面。自那时以来,养猪生产行业对猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)的认识已得到提高。回顾过去10年来PCV2在英国的流行情况,我们能够从中总结出怎样的发展趋势呢?     

猪圆环病毒2型(PCV2)感染:临床症状、病理学及实验室诊断

临床症状和病理学特征仍然是怀疑和诊断PCV2感染相关疾病的基石。随着时间推移,对该病毒感染的临床病理认识不断增加。从最初报道的断奶仔猪多系统衰竭综合征,到一些肠道、呼吸道和繁殖紊乱都与PCV2有关。一种免疫复合性疾病,猪皮炎与肾病综合征也与这种病毒感染有关。这些疾病一起被归入猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。感染PCV2的猪发展成为PCV2亚临床感染或临床PCVD/PCVAD的具体机制还有待阐明,但是对田间基本样本的基于临床、解剖和组织病变的观察有助于揭示该病毒感染的致病机理。本综述目的是更新现有对于PCV2感染的临床、病理以及它们的诊断方法的认识。此外还提出了统一的PCVD/PCVAD命名方法的提议,并给出了确切的诊断标准。     

安徽省部分地区生猪PCV2感染情况及疫苗免疫效果调查

为摸清当前安徽省猪群中PCV2感染情况及疫苗的免疫效果,本试验采集了12个猪场的289份猪扁桃体和289份猪血清样品,采用荧光定量PCR方法检测扁桃体中的PCV2,采用ELISA方法检测血清中PCV2抗体。试验结果显示:猪群PCV2感染率为11.8%,其中大型猪场、中型猪场、小型猪场感染率分别为8%、0%、26%,生产母猪、后备母猪、保育猪及育肥猪感染率分别为12%、16%、0%、17%;猪群PCV2抗体阳性率92.4%,其中大型猪场、中型猪场、小型猪场阳性率分别为96%、82%、98%,生产母猪、后备母猪、保育猪、育肥猪阳性率分别为100%、91%、82%、98%。安徽省猪群存在PCV2隐性感染,其中小型猪场及育肥猪群感染率较高;不同养殖规模、不同生长阶段猪群猪圆环病毒疫苗免疫效果良好。     

嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护

应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒(PCV1-2)及真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-ORF2作为免疫原免疫母源抗体ELISA效价在0.07～0.60不等的商品猪,9头猪随机分为4组,1组(3头)肌肉注射免疫103.5TCID50的PCV1-2/头,2组(2头)肌肉注射真核表达质粒200μg/头,3组(2头)肌肉注射空载体(pcDNA3.1)200 μg/头,4组(2头)不免疫作为攻毒对照组.于免疫后42 d,PCV1-2组及真核表达质粒组产生了PCV2抗体.免疫后42 d所有组攻毒PCV2和PRRSV,剂量分别为2×104.5TCID50/头和106TCID50/头.攻毒后21 d,攻毒对照组猪淋巴结比免疫组显著肿大,免疫组猪血清、淋巴结中PCV2病毒载量低于对照组,攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组.这些结果表明,嵌合型PCV1-2及真核表达质粒肌肉注射免疫商品猪后,对PCV2感染能产生保护性免疫应答,有可能成为候选疫苗.     

PCV2灭活疫苗对小鼠的免疫效果研究

本研究首先用猪圆环病毒2型种毒攻击Balb/c小鼠,通过病毒分离,找出可使全部小鼠感染的最低病毒含量,然后用该种毒攻击免疫后的Balb/c小鼠,评价免疫保护情况。结果显示,可使小鼠全部感染的种毒最低病毒含量为106.5 TCID50/0.1 mL,当疫苗病毒含量为105.5 TCID50/0.1 mL时即可使7/10免疫小鼠得到保护,达到了疫苗的免疫效果。该研究为现有疫苗的生产工艺改进提供了重要的参考数据。     

猪圆环病毒（PCV2）综述之二—发病机制与防制对策

现有研究证明PCV2与相关疾病的发生机制与免疫系统的损害有关;而对此猪病的防制对策又是综合性的。现将有关情况综述如下:     

浙江金华地区PCV2分子流行病学调查及遗传变异分析

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)主要引起猪的多系统功能障碍性疾病,同时,还可侵害猪的免疫系统,造成猪免疫抑制,容易继发细菌及其他病毒感染,大大增加猪群的死亡率。为了解PCV2在浙江金华猪群中的分布与流行状况以及PCV2变异规律,对从浙江省金华猪场收集的3 433份血清进行PCR检测,结果显示,2012-2018年PCV2阳性率分别为10.16%,11.95%,8.50%,9.94%,6.19%,5.94%,8.28%,母猪阳性率最高为13.49%。本研究发现在2012年浙江金华地区PCV2优势毒株已经由PCV2b变为PCV2d,且全部为PCV2d-2。将得到的ORF2序列同已知的疫苗序列对比后,发现SH株与浙江金华目前PCV2主流毒株序列一致性最高,但抗原位点比较仍有5处差异,这可能会对疫苗效果产生影响,需要进一步验证。另外只有PCV2d在免疫显性诱饵表位上发生了突变,这可能是PCV2d成为主流的原因。