抗迟缓爱德华氏菌病牙鲆家系的筛选与分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖病害日益严重,迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是牙鲆养殖中的主要致病菌,带来了极大的经济损失,为了培育出对该病抵抗能力强的牙鲆新品种,2014年4–6月间,利用我们长期以来建立和筛选出来的牙鲆抗病群体和家系的亲鱼,通过杂交,自交,雌核发育建立47个家系,9–10月间,对其中39个家系进行感染实验,先用少量鱼进行预实验摸索出半致死浓度,然后再进行正式感染实验,感染数量为每个家系80尾。各家系的存活率范围为1.19%~51.19%,最终平均存活率为20.29%,认为存活率高于30%的7个家系为抗病力强家系,存活率在20.29%~30%的9个家系为抗病力一般家系,平均存活率以下的23个家系为抗病力弱家系。1406#家系抗病力最强,它为1005#家系的自交后代,而其他抗病力强家系也大多是1005#、09104#、0915#的后代。而09104#为0768#的后代,并且0768#抗鳗弧菌病能力强。1005#为韩国群体自交后代,0915#为韩国群体和日本群体杂交后代。这些抗病力强的牙鲆可以作为新品系进行推广养殖,可望减少牙鲆腹水病发生。     

迟缓爱德华氏菌病

迟缓爱德华菌病,是由迟缓爱德华菌引起鱼类、牛蛙等水生动物疾病的统称,其中鱼类疾病有肠道败血症和肝肾坏死病、鳗赤鳍病、鳗臌胀病、鳗溃疡病、鳗肝肾病、鳗肝肾综合症等。迟缓爱德华氏菌还可引起人体肠炎、腹泻、脑膜炎、蜂窝组织炎、肝脓肿、败血症等症状。为我国的三类水生动物疫病。     

牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病家系的继代选育与早期速生家系筛选

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是牙鲆(Paralichthys olivaceus)的主要致病菌之一,严重影响牙鲆养殖业的可持续发展。本研究主要以2012、2013和2014年选育的优质抗病牙鲆家系为亲本,于2016年建立和培育了28个牙鲆家系,包括F3代家系4个、F_4代家系23个和对照家系1个。经过60 d的鱼苗早期生长性能测定和迟缓爱德华氏菌人工攻毒感染实验,筛选得到7个高抗病力(攻毒感染存活率66%)的家系,包括1个高抗病、速生家系(F1639),攻毒存活率达77.23%,比28个家系的平均值高32.75%,全长日增长率达到0.174 cm/d,比28个家系的均值高0.023 cm/d。该家系亲本源自2007年[F0750,抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)病家系]、2009年(F0927,抗鳗弧菌病家系)和2014年(F1421,抗迟缓爱德华氏菌家系)选育的抗病力强家系。历代攻毒感染实验的结果显示,选育的牙鲆家系抗病力逐代提高,说明通过家系选育(同胞选择),能够有效提高选育后代的抗病力。本研究进一步证明,家系选育是培育鱼类抗病优良品种的有效途径,为进一步培育出生长更快、抗病力更强的牙鲆新品种奠定了良好的基础,也为牙鲆对爱德华氏菌抗病性能的遗传解析和抗病机理研究提供了良好的遗传材料,对其他鱼类抗病良种选育具有重要指导作用和应用价值。     

牙鲆NOD2基因的表达分析及在抗迟缓爱德华氏菌感染过程中的功能

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。     

牛蛙感染迟缓爱德华氏菌的研究

2001年10月底，厦门地区一些牛蛙（Rana catasbianay）养殖场养殖的牛蛙暴发流行传染病，造成大批成蛙和幼蛙死亡。经流行病学调查和病原分离鉴定，确定其主要致病原为迟缓爱德华氏野生型（Edwardsiella tarda）。该菌具有溶血性，对SPF小鼠有强致死作用，对幼蛙和蝌蚪致病力较小，根据药敏实验结果，和敏感药物进行治疗取得了良好的疗效。     

罗非鱼迟缓爱德华氏菌病的分离鉴定

从广西某鱼场的发病罗非鱼(Tilapia nilotica)中分离到1株呈β溶血的革兰氏阴性杆菌,在普通琼脂平板上生长,菌落圆形,边缘整齐,灰白色,湿润菌落,直径为0.5～1.0 mm,有动力,接触酶阳性,赖氨酸及鸟氨酸脱梭酶阳性,还原硝酸盐为亚硝酸盐,发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖,经细菌形态、培养特征、生化特性测定结果均符合迟缓爱德华氏菌的特征.应用PCR技术扩增出576 bp目的片段,通过PCR产物核苷酸序列测序及Blast比对结果,进一步确定为迟缓爱德华氏菌.致病性试验结果显示分离菌株具有致病性,对氧氟沙星、氯霉素、氟哌酸、恩诺沙星、先锋霉素等高度敏感.     

养殖杂交鳢迟缓爱德华菌的分离鉴定

从患病杂交鳢[斑鳢（Channa maculata）♀×乌鳢（C.argus）♂]体内分离到2株致病菌（ZS201364-1和ZS201364-2）,通过对其生化特性与16S rRNA基因序列进行分析,确定为迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）。该致病菌兼性厌氧,为革兰氏阴性短杆菌,能运动,能发酵葡萄糖、麦芽糖。吲哚试验和MR试验均为阳性。2株致病菌对杂交鳢的半致死剂量（LD50）分别为7.1×105cfu·g^-1和5.6×105cfu·g^-1。ZS201364-1最适生长温度为25～35℃、pH为7～8、氯化钠（NaCl）质量分数为1%,对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星等抗生素高度敏感。     

养殖杂交鳢迟缓爱德华氏菌的分离鉴定

从患病杂交鳢[斑鳢(Channa maculata)♀乌鳢（C.argus) ♂]体内分离到2株致病菌（ZS201364-1和ZS201364-2）,通过对其生化特性与16SrRNA基因序列进行分析,确定为迟缓爱德华菌（Edwardsiellatarda）。该致病菌兼性厌氧,为革兰氏阴性短杆菌,能运动,能发酵葡萄糖、麦芽糖。吲哚试验和MR试验均为阳性。2株致病菌对杂交鳢的半致死剂量（LD50）分别为7.1105cfug-1和5.6105cfug-1。ZS201364-1最适生长温度为25~35℃、pH为7~8、氧化纳（NaCl）质量分数为1%,对头孢噻肟、环丙沙星、诺氟沙星等抗生素高度敏感。     

二温式聚合酶链反应鉴别诊断迟缓爱德华氏菌病

根据迟缓爱德华氏菌株23S rDNA基因,设计合成一对引物XZE15、XZE16,建立了二温式聚合酶链反应(PER)鉴别诊断迟缓爱德华氏菌株的技术.特异性试验表明,对3株迟钝爱德华氏菌株进行PCR扩增出与预期大小相一致的284 bp的特异性片段,但对3株钻鱼爱德华氏菌及其他对照鱼病病原体核酸模板的PCR扩增不出现任何条带;敏感性试验结果显示,该二温式PCR可以检测到10 Pg的迟钝爱德华氏菌DNA.     

牙鲆病原迟钝爱德华氏菌的药物敏感性测定与分析

对分离并经鉴定的牙鲆病原迟钝爱德华氏菌进行了常用抗菌类药物的敏感性测定,结果表明供试的35株迟钝爱德华氏菌,均对所测定的37种抗菌类药物中的头孢唑啉等20种药物高度敏感、对青霉素G等5种药物耐药、对氨苄青霉素等12种药物表现在株间存在差异。     

牙鲆迟钝爱德华氏菌血清型及荧光抗体检验

以迟钝爱德华氏菌的代表菌株(HC010907-1)为免疫原,制备免疫血清,对分离于牙鲆鱼的130株迟钝爱德华氏菌进行了血清型检定,结果表明:供试的130株迟钝爱德华氏菌均为同种血清型;同时以此免疫血清为第一抗体,以标准羊抗兔IgG荧光抗体为第二抗体,进行了荧光抗体技术检验迟钝爱德华氏菌的可行性试验,表明亦具有较强的特异性。     

Pathogenicity of Edwardsiella tarda to olive flounder, Paralichthys olivaceus (Temminck & Schlegel)

The LD50 and cytotoxic and enzymatic activities of both cells and extracellular products (ECPs) of eight Edwardsiella tarda strains were determined and their bacterial superoxide dismutase gene (sodB) and catalase gene (katB) were sequenced. Strains were also examined for their ability to resist the immune responses of olive flounder, Paralichthys olivaceus. LD50 values of strains (FSW910410, KE1, 2, 3, 4, 5 and 6) in olive flounder ranged between 10(2.5) and 10(5.3) cfu (colony forming units) per fish. Unlike the avirulent strain SU100 (LD50>or=10(7)), all pathogenic strains were able to survive in flounder serum and head kidney leucocytes (except for KE2). The virulent strains possessed type I sodB and katB, whereas SU100 had type II sodB but not katB. However, there was no difference between avirulent and virulent strains in haemolytic and cytotoxic activities. The results of this study demonstrated that the ability of E. tarda to resist complement activity and phagocytosis is conferred by its superoxide dismutase and catalase, which thus play an essential role in the pathogenicity of this bacterium. In addition genotyping of sodB and kat B proved to be a very useful tool to distinguish virulent from avirulent strains.     

应用Dot-ELISA快速检测牙鲆腹水病病原的研究

选用硝酸纤维素膜作固相载体,建立检测迟钝爱德华氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法。根据棋盘试验,确定迟钝爱德华氏菌免疫血清最佳工作浓度为1∶800,酶标抗体最佳工作浓度为1∶200,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。试验结果表明,Dot-ELISA方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。     

20种中草药对迟缓爱德华氏菌的体外抑菌试验

用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了20种中草药对迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）（GD080715-1、GD080715-2）的体外抗菌活性。结果表明,五倍子、乌梅、大青叶、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌浓度（MIC）〈6.25 mg/mL,最小杀菌浓度（MBC）〈50 mg/mL;吴茱萸和菖蒲有一定的抑菌作用,MBC为50～100 mg/mL;而苦地丁、栀子的抑菌作用不明显,MBC〉200 mg/mL。