粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS：：PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中，构建重组布鲁菌M111（pBBRlMCS：：PR-PL-E）。重组菌株在28℃培养，42℃诱导表达裂解酶E，从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线，计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示，成功制备了布鲁菌菌壳，温控裂解质粒pBBRIMCS：：PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100％。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出，细菌表面出现不同程度的皱缩，细胞形态发生变化。结果表明，本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳，初步研究了其基本特性，为下-步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的安全性和免疫原性

以粗糙型布鲁菌M111株和重组裂解质粒制备出布鲁菌菌壳,利用小鼠模型对布鲁菌菌壳、布鲁菌M111活菌和福尔马林灭活菌的安全性和免疫原性进行比较研究。结果显示,与布鲁菌弱毒菌株M111比较而言,布鲁菌菌壳具有更好的安全性,免疫小鼠后能产生与弱毒菌株相似的血清抗体水平、脾CD3+和CD4+T淋巴细胞反应,甚至产生更高水平的IFN-γ。这些结果表明,布鲁菌菌壳具有与弱毒菌株相似的体液免疫和细胞免疫能力,将来可能作为预防布鲁菌感染的新型候选疫苗,但布鲁菌菌壳疫苗的有效性和特异性免疫机制还有待深入研究。     

布鲁菌分子标记菌壳株的构建与鉴定

旨在构建一种安全、高效的犬布鲁菌分子标记疫苗株。本试验将温控裂解部件(TLC)插入布鲁菌自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419中,构建温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-ΔB0419-TLC;通过电转化方式转入犬布鲁菌RM6/66感受态中,经卡那抗性和蔗糖培养基的正、负向筛选,将TLC片段定点插入布鲁菌B0419基因中,获得犬布鲁菌分子标记菌壳株。采用PCR法对连续30代次的菌株进行鉴定,结果显示裂解E基因和靶向插入位点区域(B0419基因)并未出现丢失和回复突变现象,表明该菌壳株具有良好的遗传稳定性。该菌壳株在培养至D_(600)值为0.6时,经42℃诱导60 h后,可获得裂解率达100%的犬布鲁菌菌壳;经超薄切片和染色处理后,在透射电镜观察下可见形态完整的空心结构,其内容物明显减少。本试验结合细菌菌壳技术与同源重组技术,成功构建了具有分子标记特征的犬布鲁菌菌壳株,为新型布鲁菌疫苗的研制提供策略。     

荧光报告质粒构建及其在布鲁菌细胞侵袭试验中的应用

采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBR1MCS-2经KpnⅠ酶切后连接,转化DH5α,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A.1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。     

犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备简

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174 DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上扩增出蛋白裂解部件（protein lysis component,PLC）,该部件包含阻遏蛋白cI857、溶菌E基因及终止序列rrnbT1T2,然后将其克隆至广宿主表达载体pBBR1MCS-2中,最终将构建的广宿主裂解质粒pBBR+PLC电转入犬布鲁氏菌RM6/66中。试验结果表明,经42 ℃诱导后,广宿主裂解质粒对犬布鲁氏菌RM6/66的裂解率达100%,成功制备了犬布鲁氏菌RM6/66菌壳疫苗。本试验通过菌壳技术制备的犬布鲁氏菌疫苗对预防宠物犬布鲁氏菌病起到重要作用,同时也对人兽布鲁氏菌疫苗的研制提供新策略。     

荧光报告质粒构建及其在布鲁菌细胞侵袭试验中的应用

采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBRlMCS-2经KpnI酶切后连接,转化DH5a,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A．1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。     

双重溶菌质粒制备鸡痢疾志贺菌菌壳的研究

通过将2种不同的重组溶菌质粒转化至鸡痢疾志贺菌中,构建含有双重溶菌质粒的志贺菌重组菌株,以提高该菌菌壳制备的裂解率和稳定性,并对其特性进行研究.用重组溶菌质粒pBV220::E和pBBRIMCS-E共同转化到鸡痢疾志贺菌,构建志贺菌重组菌株Sd(pBV220::E/pBBRI MCS-E),重组菌株于28 C培养至D600值为0.5时升至42℃继续培养,间隔30 min检测菌液D600值,进行重组菌株的溶菌裂解动力学比较试验,绘制裂解曲线图并计算出裂解率,制备菌壳并对其形态进行电镜观察.重组菌株Sd(pBV220::E/pBBRIMCS-E)经42℃诱导后可形成菌壳且保留了基本的细胞形态,裂解率达到了99.999 9％.本研究成功制备出鸡痢疾志贺菌菌壳,为研究利用该菌菌壳预防鸡痢疾志贺菌病的可行性奠定了基础.     

牛致病性大肠杆菌菌影的制备

制备牛源大肠杆菌菌影,为其作为疫苗及载体奠定基础。将裂解质粒PHH43-E电转入牛大肠杆菌中,并通过温度的改变诱导细菌裂解,即其在37℃条件下生长到对数生长期,然后进行42℃升温诱导。经温控诱导裂解质粒表达后可将细胞壁裂解,形成细菌空壳,成功制备了菌影。     

表达Omp31基因重组牛布鲁菌的构建及鉴定

为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。     

利用温控双表达载体制备印第安纳沙门菌菌蜕

为制备安全高效的印第安纳沙门菌菌蜕,本研究以温控质粒pTCV为载体,分别构建出只含噬菌体PhiX174裂解基因E的pTCK01质粒、同时含裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A(SNA)的pTCK02质粒及对裂解基因E和SNA密码子优化后的pTCK03质粒,分别转化印第安纳沙门菌S1105后经42℃诱导表达,并对各重组菌开...