复方柴芩颗粒对实验性黄曲霉毒素慢性中毒鸭CYP450酶表达的影响

建立肉鸭黄曲霉毒素（AFB1）慢性中毒模型,设立正常组、AFB1模型组、亚硒酸钠组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组,采用荧光定量PCR（RT-PCR）法和免疫蛋白印迹（Western\|bolt）法检测肝标本中 CYP3A4,CYP1A2,CYP2E1的mRNA和蛋白表达来探讨复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒肝脏微粒体细胞色素P450（cytochrome P450,CYP450）酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1表达的影响,并借此深入探讨其解毒机制。结果显示,与模型组相比,中药高、中、低3个剂量组用药7,14和21 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1的mRNA相对表达量显著降低。与模型组相比,中药高、中、低3个剂量组用药7～14 d,则CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1蛋白表达量显著降低;用药21 d后高剂量组3种基因型蛋白表达量显著降低。研究表明,复方柴芩颗粒连续用药1～2周能有效地降低由鸭黄曲霉毒素慢性中毒引起的CYP1A2,CYP2E1,CYP3A4 mRNA相对表达量和蛋白表达量升高的趋势,但随用药时间增加,各组的CYP1A2,CYP2E1,CYP3A4 mRNA相对表达量和蛋白表达量逐渐升高。     

复方柴芩颗粒对鸭黄曲霉毒素慢性中毒CYP450酶活性的影响

建立肉鸭aflatoxin B1（AFB1）慢性中毒模型,设立正常组、模型组、亚硒酸钠组、复方柴芩颗粒（中药）高、中、低剂量组。造模后第7,14和21天处死肉鸭取肝,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肝标本中CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性。结果表明,与模型组相比,中药高、中、低剂量组用药7和14 d后肝脏微粒体细胞色素P450酶系CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性显著降低;用药21 d后CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性升高,但与模型组相比差异不明显。说明前期复方柴芩颗粒通过抑制CYP3A4,CYP1A2和CYP2E1活性,减少AFB1前体物质代谢激活,降低其化学性肝脏损伤达到保护肝脏的作用。而用药后21 d CYP450活性升高的原因可能是AFB1蓄积较多,需要更多的CYP450代谢AFB1。     

荭草提取物对大鼠CYP450酶的抑制作用评价

[目的]考察荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP450中6种亚型酶的体外抑制作用,从而预测发生药物相互作用的可能性,为临床合理用药提供科学依据.[方法]在肝微粒体孵育体系中,将荭草提取物分别与混合探针底物(非那西丁/CYP1A2、氯唑沙宗/CYP2E1、右美沙芬/CYP2D4、奥美拉唑/CYP2C19、甲苯磺丁脲/CYP2C11、睾酮/CYP3A2)共同孵育,UPLC-MS/MS检测各探针底物的代谢物生成量,采用GraphPad v5.0软件计算半数抑制浓度(IC50).[结果]荭草提取物对大鼠肝微粒体中CYP1A2、CYP2E1、CYP2D4、CYP2C19、CYP2C11和CYP3A2的IC50值在85.75～345.00μg/mL.[结论]在临床剂量下,荭草提取物对大鼠肝微粒体CYP2C19、CYP2D4有弱抑制作用,对CYP1A2有强抑制作用.     

重组CYP3A46细胞微粒体体外药物 代谢动力学分析

通过对巴马小型猪CYP3A46 重组细胞微粒体体外药物代谢动力学特征比较分析,为巴马小型猪应用 于临床前药理试验提供科学依据。分析重组CYP3A4、CYP3A46 细胞微粒体药物代谢动力学参数Vmax、Km(S50）、 Clint 及IC50 均表明：CYP3A46 的硝苯地平、睾酮的代谢活性及酮康唑的抑制活性均比较接近CYP3A4(P>0.05）, CYP3A46 是否是CYP3A4 的同源酶需要进一步研究确定。     

辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性及其表达水平的影响

[目的]研究辛硫磷暴露对鲫鱼肝微粒体中细胞色素P4501a(CYP1A)活性及其mRNA和蛋白表达的影响,明确其剂量—效应及时间—效应关系,为揭示有机磷农药对水生生物的代谢调节机制提供理论依据.[方法]设辛硫磷低、中、高浓度组(0.0825、0.165和0.33 mg/L)和丙酮(助溶剂)对照组,采用半静态染毒法染毒鲫鱼,分别于染毒24、48、72和96 h后取样并迅速剖解取出鲫鱼肝胰脏,以CYP1A相关酶7-乙氧基-3-异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)活性反映CYP1A活性,采用实时荧光定量PCR和Western blotting分别测定鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达情况.[结果]辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性产生抑制作用,辛硫磷染毒24 h时CYP1A活性与辛硫磷存在明显的剂量—效应关系;各辛硫磷浓度组间均存在明显的时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性分别较对照组下降54.7%、30.4%和65.5%,且差异极显著(P<0.01,下同).辛硫磷染毒后,鲫鱼肝微粒体中CYP1A基因mRNA的表达整体上呈明显下调趋势,各染毒时间组间均存在较强的剂量—效应关系,除染毒48 h时CYP1A基因mRNA相对表达量与辛硫磷浓度呈正相关外,其他染毒时间点均呈负相关.辛硫磷对鲫鱼肝微粒体中CYP1A蛋白表达的影响均达极显著水平,且呈明显的剂量—效应及时间—效应关系,至染毒96 h时低、中、高浓度组的表达量分别较对照组降低74.6%、82.6%和85.7%.[结论]辛硫磷能抑制鲫鱼肝微粒体中CYP1A活性并下调CYP1A基因mRNA及其蛋白的表达;相对于辛硫磷产生的剂量—效应影响,其对CYP1A活性及其蛋白表达的时间—效应影响更明显.     

猫眼草黄素对不同来源大鼠肝微粒体CYP450亚酶活性影响的对比研究

采用“Cocktail”探针底物法,分别以咪达唑仑、非那西丁、香豆素、奥美拉唑、氯唑沙宗、右美沙芬、甲苯磺丁脲作为CYP3A4、1A2、2A6、2C19、2E1、2D6、2C9的特异性探针底物,采用RP-HPLC-UV测定体系中底物浓度变化,比较猫眼草黄素对不同来源肝微粒体体系中(市售/自制)各亚酶活性影响及抑制类型差异。结果表明：猫眼草黄素在市售大鼠肝微粒体孵育体系中,对CYP1A2、3A4、2E1、2C19存在抑制作用,IC₅₀值分别为0.005 (CYP1A2)、0.006 (CYP2C19)、0.003 (CYP3A4)、0.028 (CYP2E1) mmol·L^-1,表明其对1A2、3A4抑制活性更强,但对3A4可能存在低浓度诱导、高浓度抑制的双重调节。抑制类型分别为非竞争性抑制和反竞争性抑制,K_i值分别为0.004 1、0.003 7 mmol·L^-1;在自制大鼠肝微粒体体外孵育体系中,药物对CYP2C9、2A6、3A4存在不同程度的抑制作用,但反而显著提高CYP2C19酶活性,且无法确...     

速眠新对大鼠原代肝细胞CYP3A1、CYP2E1的影响

胶原酶二步灌流法获取原代大鼠肝细胞,用不同浓度的速眠新和保定宁处理,Western blot法测定肝细胞中细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP 2E1)的表达水平.结果表明:通过胶原酶灌流法,每只大鼠可获得2～4×108个肝细胞,成活率约为95%.用速眠新、保定宁处理后,肝细胞CYP3A1和CYP2E1的表达随速眠新、保定宁浓度的增加和处理时间的延长而呈升高的趋势.原代大鼠肝细胞可用于速眠新药物代谢分子机制的研究,为其临床上合理地应用提供了理论依据.     

采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性

【目的】探究双峰驼CYP3A酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响。【方法】将双峰驼禁食过夜12 h,颈静脉放血处死后,立即于肝门静脉处采集块状肝脏组织,洗去血污称重匀浆后,采用Ca²⁺沉淀法制备双峰驼肝微粒体,并通过BCA法测定其蛋白含量。同时优化双峰驼肝微粒孵育体系,取不同浓度的双峰驼肝微粒体蛋白悬液（0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg?mL^-1）、不同浓度的探针药物咪达唑仑（MDZ）（7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg?mL^-1）分别加入到孵育体系中,37℃预孵育5 min后,加入NADPH溶液后再孵育不同时间（0、2、5、10、15、20、25、30 min）。待反应完全后加入冰冷的甲醇和地西泮（DZP）溶液,涡旋混匀,800 µL全部混合液体经14 500 r/min离心20 min后,取20 µL上清液进行高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV）,确定最适底物浓度、最适酶浓度以及最适孵育时间。分别取浓度为7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg?mL^-1 MDZ探针药物溶液20 µL与双峰驼肝微粒体共同孵育15 min后,以混有内标DZP的冰冷甲醇终止反应,采用高效液相色谱紫外检测法测定反应产物1'-羟基咪达唑仑（1'-OHMDZ）的动态含量,计算出部分药物动力学参数。色谱条件：Sigma-Aldrich/Supelco Discovery C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）;流动相为V（乙腈）﹕V（0.01 mol?L^-1 PBS缓冲液）= 40﹕60;等浓度洗脱20 min;检测波长为254 nm;流速为0.8 mL?min^-1;柱温为30℃;进样量为20 μL。【结果】使用Ca²⁺沉淀法制备的双峰驼肝微粒体保持了酶的良好活性,能满足后续体外药物代谢试验的基本要求,经BCA法测定其蛋白含量为(1.936±0.052) mg?mL^-1。双峰驼肝微粒体蛋白悬液、探针药物MDZ、PBS缓冲液、MgCl₂溶液以及NADPH溶液构成双峰驼肝微粒体孵育体系,随着孵育时间的延长,酶和底物进一步反应,当MDZ浓度为125 µg?mL^-1（终浓度为7.073 nmol?mL^-1）,肝微粒体浓度为2.000 mg?mL^-1（终浓度为0.050 mg?mL^-1）时,孵育15 min,酶和底物的结合最紧密,并呈现出饱和的状态,故确定其终浓度和时间为最适浓度和最佳孵育时间。经HPLC-UV法测定,1'-OHMDZ、MDZ和DZP的出峰保留时间分别为6.710、11.383和15.263 min,各成分色谱峰分离良好,且不受肝微粒体孵育体系中其他干扰峰的影响。HPLC检测方法的精密度、稳定性及回收率的试验结果均符合色谱测定的基本要求,即成功建立了准确、灵敏、可靠、重现性好的双峰驼CYP3A酶特异性探针药物的检测方法。以底物MDZ浓度和反应产物1'-OHMDZ生成速率进行Lineweaver-Burk双倒数作图,分别计算出最大反应速度V_max和米氏常数K_m。经Origin Pro8.6软件进行线性回归分析得到最大反应速度V_max为(0.380±0.028)nmol?mg^-1?min^-1,米氏常数K_m为(9.603±3.229)nmol?mL^-1,以此体现酶和底物的反应情况,并对双峰驼CYP3A酶的活性进行了间接测定。【结论】成功建立了跟踪检测CYP3A酶的特异性探针药物MDZ及其代谢产物浓度的高效液相色谱紫外检测方法。MDZ在体内经CYP3A酶的特异性氧化代谢后主要生成1'-OHMDZ,本文以MDZ的代谢产物1'-OHMDZ的生成速率为检测指标,首次对双峰驼CYP3A酶的体外活性及酶与底物的相互作用特点进行了研究。     

大黄素对建鲤生长性能、抗氧化指标及肝脏CYP450酶的影响

为全面评价大黄素(emodin, EMD)对水产动物的保肝作用,在基础饲料中添加含1、3、5 g/kg的大黄素,将100尾初体质量约150 g的建鲤Cyprinus carpio Jian随机分为5组,分别为空白对照组(control)、模型组(CCl_4)、低剂量药物组(1 g/kg EMD)、中剂量药物组(3 g/kg EMD)和高剂量药物组(5 g/kg EMD),每组设2个平行,每个平行10尾鱼,投喂60 d后,一次性腹腔注射30%的CCl_4以诱导肝损伤,72 h后测定各组建鲤的生长指标、肝指数、生化指标、抗氧化指标、肝组织CYP450酶总活性及CYP1A和CYP3A的mRNA表达。结果表明:大黄素具有较强的清除DPPH自由基的能力,当大黄素浓度为6μg/mL时,其清除自由基的能力达81%;含3、5 g/kg大黄素的饲料能显著提高建鲤的相对增重率和特定生长率并显著降低饵料系数(P<0.05);含3、5 g/kg大黄素饲料能稳定肝细胞膜,显著抑制谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)及乳酸脱氢酶(LDH)的溶出且显著恢复血清中白蛋白和总蛋白含量(P<0.05);大黄素可有效缓解建鲤氧化应激程度,能显著促进肝组织匀浆中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的恢复(P<0.05),同时显著抑制丙二醛(MDA)生成(P<0.05);大黄素能显著降低肝组织CYP450酶含量(P<0.05),抑制CCl_4诱导的CYP1A、CYP3A基因表达上调。研究表明,饲料中添加3～5 g/kg大黄素具有显著的保肝作用,该作用与其抗击氧化、清除自由基、提高生长性能、抑制CCl_4对CYP450酶的诱导作用有关。     

细胞色素酶P450参与了雏鸡和鹌鹑体内黄曲霉毒素B1的代谢

研究旨在确定细胞色素酶P450同源物(CYP,CYP450)参与了黄曲霉毒素B1(AFB1)转换成更高毒素代谢产物,即雏鸡和鹌鹑肝微粒体代谢物——黄曲霉毒素-8,9-环氧化物(AFBO)的生物活化过程。包括特定细胞色素P450酶抑制剂的使用和AFBO生产的典型基底物质活性间的关系。此外,酶的定性测定采用免疫印记技术。结果表明,雏鸡和鹌鹑体内微粒体代谢物酶有CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6和CYP3A4。CYP1A1和CYP2A6两个菌种的活性和AFB1的生物活化过程紧密相关。研究证明了CYP2A6在AFB1的生物活化过程中的作用,免疫印迹结果显示,CYP2A6和CYP3A4两个物种的同源物的条带清晰,研究结果表明,在较小程度上,CYP2A6和CYP1A1是AFB1生物活化成雏鸡和鹌鹑肝微粒体代谢物AFBO的原因。     

苯巴比妥对鸡肝微粒体CYP450活性的影响

选取40日龄依莎公鸡40只,随机分为2组,每组20只。对照组:每日腹腔注射生理盐水4 mL/kg,PB组:每日腹腔注射苯巴比妥80 mg/kg。连续处理5 d后,进行体外肝微粒体酶活性测定和体内探针药物安替比林(AP)消除动力学试验。结果表明,PB组的肝脏指数、肝微粒体蛋白含量和细胞色素P450含量、氨基比林-N-脱甲基酶(AND)、红霉素-N-脱甲基酶(ERND)和苯胺羟化酶(AH)的活性均极显著高于对照组(P<0.01),安替比林消除速率明显快于对照组。苯巴比妥对鸡肝微粒体CYP450具有明显诱导作用。     

细胞色素P450新家族的第一个基因CYP337A1的分子克隆与序列分析

依据家蚕基因组数据, 通过BLASTP比对, 选择了主要与抗性相关的CYP3集团(clan)中具有完全编码框并含有P450基因特征结构域的1条序列为研究对象, 用RT-PCR方法对其进行了克隆. 结果表明, 该基因ORF为1 467 bp, 编码489个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.60 KDa, 等电点为8.64. 只有1个内含子, 外显子/内含子边界处符合GT-AG规则. 与美国棉铃虫的CYP321A、邪恶按蚊的CYP6P9的相似性(identity)相对较高, 分别为34%、 32%, 低于同一家族成员氨基酸相似性应高于40%的规定, 从而被细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1(GenBank 登陆号: EF415297).     

根癌农杆菌介导CYP1A1转化菠萝的研究

将菠萝(Ananas comosus)愈伤组织经含有植物表达重组质粒(pUHA1-CYP1A1)的根癌农杆菌(LBA4404菌株)侵染后,在MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+100μmol/LAS+8g/Lagar上共培养3d,转入选择培养基(MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+20mg/LKm+400mg/LCarb+8g/Lagar)上培养约10d后开始分化出不定芽;28d后将绿色的抗Km不定芽转入MS+2.0mg/LNAA+30mg/LKm+300mg/LCarb+8g/Lagar上再进行连续2轮选择,随后将绿芽转入MS+1.0mg/LIBA+30mg/LKm+8g/Lagar上生根,共获得95株Km抗性植株,转化率0.12%～2.69%.对其中部分的抗Km植株进行PCR检测,PCR阳性植株率达64.29%.经Southern杂交进一步证实,CYP1A1已整合到菠萝基因中.以琼脂为培养基凝固剂、共培养基中添加AS、增加选择次数和逐渐增加新一轮选择培养基中的Km质量浓度等是根癌农杆菌介导菠萝愈伤组织获得转基因植株的重要条件.     

复方益母生化散对奶牛子宫内膜细胞CYP450表达和免疫功能的影响

【目的】探讨复方益母生化散对奶牛子宫内膜炎的作用机理。【方法】体外实验:分离奶牛子宫内膜细胞,细菌脂多糖(LPS)诱导子宫内膜细胞炎症模型,复方益母生化散处理子宫内膜炎症细胞48h、72h,Western blotting法检测CYP450的表达;体内实验:复方益母生化散栓剂治疗患有子宫内膜炎的奶牛,检测血清中IgG、IgA含量的变化。【结果】复方益母生化散处理后,子宫内膜炎症细胞CYP450的表达随复方益母生化散剂量的增加而呈升高的趋势,血清中IgG、IgA的含量与对照组相比明显升高。【结论】2000μg·mL-1的复方益母生化散作用奶牛子宫内膜炎症细胞48h,CYP450的表达最明显。     

黄芩等中药提取物对异育银鲫肝微粒体CYP1A和CYP3A的抑制作用

通过肝微粒体体外孵育实验,研究黄芩、柴胡、连翘、吴茱萸和野菊花5种中药提取物对异育银鲫肝微粒体CYP450的影响。体外给药测定IC₅₀以及相关酶动力学参数,并推测其可能的作用机制。结果显示, 5种中药对7乙氧基异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD) (CYP1A标志酶)的抑制程度为黄芩>连翘>野菊花>柴胡≈吴茱萸,半抑制浓度（₅₀）依次为0.27,2.88,7.62,16.20和16.42 mg/mL,酶促反应动力学常数V_max 和K_m为（83.33±11.32） pmol/(min·mg)和（3.05±0.89） μmol/L。据此计算黄芩、连翘、野菊花、柴胡和吴茱萸的抑制常数分别为0.16、0.39、0.61、0.40和0.59 mg/mL;黄芩、连翘和吴茱萸对红霉素N-脱甲基酶（ERND）（CYP3A标志酶）有很弱的抑制作用,IC₅₀分别为90.9,70.8和43.5 mg/mL。柴胡和野菊花未检测到对ERND有抑制作用。结果表明,这5种中药对CYP酶的影响因亚型不同而差别较大,对CYP1A的抑制均较显著,而对CYP3A的抑制则不明显。进一步研究它们对CYP1A的抑制机制,推测黄芩、柴胡和吴茱萸对EROD的抑制为竞争性抑制,野菊花和连翘则是反竞争性抑制。建议这5种中药与其他渔药合用时,要注意其引起其他渔药的药动学的变化,使疗效发生改变。     

猪的21—羟化酶基因位点限制性片段长度多态性研究

采用纯种大约克和纯种二花脸猪血样提取基因组ＤＮＡ，分别用１１种限制必内切酶消化，以非放射性狄高辛试剂盒标记４．８ｋｂ２１－羟化酶（ＣＹＰ２１）基因方为探针，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交对猪的ＣＹＰ２１基因位点的限制性片长度多态性（ＲＦＬＰＳ）进行了研究。结果在ＢａｎＩ、ＨｉｎｄⅢ、ＫｐｎⅠ、ＰｓｔⅠ和ＴａｑⅠ５种限制性内切酶位点检测出了ＰＦＬＰＳ，且ＢａｎⅠ和ＫｐｎⅠ酶切位点的多态性为首次发现；而在其他     

微囊藻毒素对鲢鱼肝脏GST和CYP7A1基因表达的影响

为探究微囊藻毒素(MC)对鲢鱼肝脏谷胱甘肽S转移酶(GST)和胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)基因表达的影响,克隆了鲢鱼肝脏GST和CYP7A1基因的部分c DNA片段,并对饲养密度为1.3×108cell/L的有毒和无毒两种铜绿微囊藻水体中第2 d、第4 d和第6 d的鲢鱼肝脏取样,通过RT-PCR与Q-PCR技术分析肝脏GST和CYP7A1基因在MC影响下不同时间点的表达情况。结果显示,有毒铜绿微囊藻水体中鲢鱼肝脏GST相对表达量在第6 d显著下降,说明GST基因在第6 d时在MC解毒过程中开始发挥作用;鲢鱼CYP7A1相对表达量自第2 d开始显著下调并随时间延续维持在一个较低的水平,说明MC作用下CYP7A1表达受到抑制,可能对胆汁酸合成造成影响。为进一步研究鱼类微囊藻毒素去毒基因以及抑制对MC转运和吸收的关键基因提供依据。