芽孢杆菌Pb-4菌株鉴定及其抑菌活性的研究

拮抗菌Pb-4是一株对多种植物病原菌有较强抑制作用的菌株。为了明确拮抗菌Pb-4的分类地位和抑菌机理,通过形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性比对及系统发育树分析,对Pb-4菌株进行鉴定。并采用平板对峙培养法测定Pb-4菌株的抑菌谱,显微观察其抑菌作用,采用硫酸铵沉淀和乙醚、苯提取得到抑菌活性物。通过加热处理,明确高温对Pb-4菌株抑菌活性的影响。结果表明,Pb-4菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌;Pb-4菌株对番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、苹果腐烂病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有广谱性。该菌菌液能明显抑制枯萎病菌孢子的萌发,并对病菌菌丝有致畸作用;对番茄枯萎病菌的抑制生长率达93%,经100,121℃高温处理后的抑菌活性分别是未处理菌液的98.9%和80.1%。从菌液中提取的蛋白、酶、抗生素类活性物质对枯萎病菌的生长繁殖均有很强的抑制效果。为Pb-4菌株在病原菌防治中的广泛应用提供强有力的理论依据。     

类芽孢杆菌YS-1化学成分及其抑菌活性研究

为研究类芽孢杆菌YS-1发酵液抑制柑橘采后两种主要病原菌-意大利青霉(Penicillum italicum)和指状青霉(Penicillium digitatum)的活性成分,本研究对YS-1发酵液抑菌成分进行了靶向分离研究。YS-1发酵液离心去除菌体后,采用正丁醇萃取得到粗提物,硅胶和Sephadex LH-20凝胶柱层析对粗提物进行分离;赣南脐橙活体损伤接种验证分离得到的化合物及其糖苷的抑菌活性。从粗提物中分离得到一个单体化合物,通过质谱,核磁共振H谱(~1H-NMR)、C谱(~(13)C-NMR)和二维核磁共振谱(2D-NMR)等方法鉴定其结构为胞嘧啶。抑菌结果表明胞嘧啶及胞嘧啶核苷均有一定的抑菌效果,但是胞嘧啶抑菌效果较好,表明胞嘧啶为类芽孢杆菌YS-1的一个主要抑菌活性成分,为生防菌类芽孢杆菌YS-1控制柑橘采后病害的开发和利用提供了基础。     

芽孢杆菌GSBM05对葡萄白腐病菌的抑菌活性及其鉴定

旨在从土壤中分离筛选出对葡萄白腐病菌有强烈抑制作用的芽孢杆菌,检测其抑菌活性并进行鉴定。采用稀释平板法从土壤中分离芽孢杆菌,利用对峙培养和菌丝生长速率等方法对抑菌活性较好的芽孢杆菌GSBM05进行初步研究。结果表明,在土壤样品中共分离出40株芽孢杆菌,经初筛、复筛后得到1株具有强烈抑制效果的芽孢杆菌GSBM05。该菌株稀释20倍的无菌发酵液对孢子萌发和菌丝生长抑制率均在90%以上,发酵液不同组分对葡萄离体果实、叶片的防治效果均可达80%以上。该菌株对葡萄白腐病菌等11种植物病原菌具有良好的拮抗作用。通过形态观察、生理生化鉴定以及16S r DNA序列分析,确定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。实验结果表明,甲基营养型芽孢杆菌GSBM05具有良好的抑菌活性,抑菌谱较广,可为葡萄白腐病生物防治提供新资源。     

枯草芽孢杆菌B26抑菌活性成分稳定性研究

枯草芽孢杆菌B26发酵液离心过微孔滤膜后,用质量分数为70%的硫酸铵沉淀,透析后获得仍具有拮抗多隔镰孢霉的无菌粗提物。进一步检测了粗提物对温度、酸碱度、紫外线照射、有机溶剂和蛋白酶处理的稳定性。结果表明,B26粗提物对高温具有一定的耐受性,经100℃处理后,是常温处理下抑菌直径的78.2%,但经121℃处理后,B26粗提物完全失去活性。B26粗提物具有较宽的pH值适应范围,在pH值3～10时都具有抑菌活性,且在pH值为7时的抑菌能力最高。粗提物对紫外线照射有部分敏感性,经距离40cm、功率20W的紫外灯照射80min后,抑菌活性是对照的78.1%。有机溶剂对B26抑菌粗提物的活性影响很小,经乙醚,甲醇,氯仿和丙酮处理30min后,粗提物抑菌活性分别为对照的96.4%,85.7%,82.1%,81.5%。B26抑菌粗提物对蛋白酶具有部分敏感性,蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后的拮抗直径分别为15.2,16.2,16.3mm,抑制率分别是对照的76.7%,81.8%和83.3%。     

拮抗灰霉病菌的芽孢杆菌筛选、鉴定及其代谢产物抑菌效果研究

筛选获得对灰霉病菌具有抑制活性的芽孢杆菌菌株,明确其胞外抑菌物质的活性及稳定性,为灰霉病提供安全、高效、易行的生物防治方式,并为其后续生防制剂的研发提供科学依据。采集我国云南、黑龙江、新疆、河北等地蔬菜种植土壤样品129个,采用稀释涂平板法分离获得芽孢杆菌4 200株,采用平板对峙法获得191株具有灰葡萄孢菌拮抗性能的菌株,其中菌株KA4的抑菌能力最强,对灰霉病菌的抑菌率为65.34%。采用形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB基因序列分析相结合的鉴定方法进行了KA4菌株的鉴定,将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌,命名为BA-KA4。BA-KA4的无菌发酵液具有较强的抑菌活性,稀释10,20,40倍的无菌发酵液对灰葡萄孢菌的抑菌率分别为78.83%,65.19%,45.38%。通过单因素法测定了不同处理温度、pH值和紫外照射时间对BA-KA4无菌发酵液抑菌活性的影响,该菌株的无菌发酵液具有良好的温度、pH和紫外线稳定性。综上,解淀粉芽孢杆菌BA-KA4能够抑制灰霉病菌生长、胞外抑菌物质活性稳定,可作为灰霉病生物防治的优良微生物资源,具有良好的开发前景。     

黄瓜枯萎病生防芽孢杆菌的定向筛选及其抑菌活性物质特性分析

研究拟从北京郊区黄瓜根际土壤中定向筛选黄瓜枯萎病菌生防芽孢杆菌,并研究其抑菌活性物质的基本特性。采用热处理和形态观察结合平板对峙法定向筛选黄瓜枯萎病菌拮抗菌。从北京郊区黄瓜根际土壤中定向分离到63株产芽胞的菌株,从中筛选到2株对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.cucumarinum Owen.）具有较好拮抗作用的菌株,命名为j-28和j-50。拮抗菌j-28对黄瓜枯萎病菌的抑菌带达到11.0 mm。此外,拮抗菌j-28有较广的抑菌谱,对黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、马铃薯干腐病菌（Fusarium sulphureum）和茄子黄萎病菌（Verticilllium albo-atrum）等具有很强的拮抗作用。经过形态观察、理化分析和分子鉴定,j-28和j-50鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。研究还发现拮抗菌j-28的发酵液经过高温和强酸碱处理后抑菌效果会明显减弱,说明拮抗菌j-28产生的主要抑菌活性物质可能是蛋白类。笔者定向筛选到针对北京郊区多发的黄瓜枯萎病菌拮抗菌枯草芽孢杆菌j-28,具有潜在的应用价值,为今后北京郊区黄瓜枯萎病菌的防治提供新的生物防治资源。     

1株枯草芽孢杆菌的分离鉴定及其发酵条件优化

为筛选出对黄瓜枯萎病具有生防作用的拮抗菌,利用平板对峙法从黄瓜根际土壤中分离获得1株对黄瓜枯萎病的致病菌尖孢镰刀菌具有较强抑制作用的细菌,通过形态特征、生理生化特征及16SrRNA序列分析,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对其发酵条件进行了优化,获得的最佳发酵条件：种龄10 h,接种量4%,发酵温度32℃,装液量50 mL/250 mL,发酵转速180 r/min,发酵时间36 h,采用优化后的发酵条件,发酵液菌落数比初始值提高了172%。     

5株芽孢杆菌的分离鉴定、拮抗性试验与抑菌效价测定

（辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁抚顺 113001）     

益生菌芽孢杆菌的分离与初步鉴定

鉴于抗生素在饲料添加剂中的滥用,研究高效复合益生菌来替代抗生素已变得越来越重要。益生菌是一类新型饲料（食品）添加剂,可改善人畜肠道环境,减少体内有害菌群及有害物质含量。在本实验中,利用大肠杆菌(Escherichia coli)为抑菌对象,分离到4株益生菌,实验证明其抑菌效果理想,经过经形态学观察及传统生理生化实验分析表明：本实验所获得的4株菌均为芽孢杆菌(Bacillus spp.),为进一步开发高效复合益生菌奠定菌种基础。     

枯草芽孢杆菌XK-1产芽孢条件的优化

为在最大程度上提高有机磷降解菌-枯草芽孢杆菌XK-1的芽孢产量,对其产芽孢的条件进行系统研究。以菌体芽孢化的方式增强该菌适应性,采用单因素和正交试验的方法,考察不同的氮源、碳源、无机盐、pH、温度、培养时间、接种量对枯草芽孢杆菌形成芽孢的影响。结果表明：XK-1产芽孢的最佳培养基组成为：3%麸皮,3%大豆蛋白胨,0.1% CaCl2,0.05% NaCl,在此基础上的最佳培养条件为pH 7.5,温度为40℃,发酵时间为48 h,接种量为2%。经优化后,该菌株的产芽孢率达96%,为下一步该菌株在复合生物肥中的应用打下基础。     

生姜中抗黑曲霉活性内生细菌的筛选与鉴定

为了找到一株具有安全、高防霉性特点的内生菌,以解决高水分粮食储藏时使用化学防霉剂的安全、成本问题。试验使用70%乙醇、10%次氯酸钠、5%石碳酸对生姜进行表面灭菌,使用研磨液梯度稀释结合平板划线法从生姜中分离到13株内生细菌。通过菌体对峙试验得到1株对黑曲霉具有明显抑制作用的内生细菌JT716。结合形态学特征、生理生化试验以及16S rDNA同源性分析鉴定该菌为荧光假单胞菌。     

五岳寨苏云金芽孢杆菌资源多样性分析及杀虫基因的鉴定

分离筛选高效广谱野生苏云金芽孢杆菌菌株并对五岳寨地区苏云金芽孢杆菌资源多态性进行分析。采用温度筛选法进行菌株分离筛选,光学显微镜下观测菌株的晶体形态,通过PCR-RFLP和SDS-PAGE法对这些菌株进行基因鉴定和蛋白分析,并进行生物活性测定。从土壤中分离得到72株Bt菌株,共包含13种cry基因,9种基因组合,另有8株未鉴定出基因型,SDS-PAGE蛋白分析发现这些菌株主要表达130、90、50 kDa蛋白;生物活性测定结果显示有20株对小菜蛾和棉铃虫具有高效毒力,另有4株对华北大黑鳃金龟有高效毒力,其中2株的校正死亡率可达80%。五岳寨地区苏云金芽孢杆菌资源丰富并具有良好的多态性。     

一株生防细菌的分离鉴定及其抑菌活性物质的分析

随着人们对农产品品质和安全性要求的提高,高效生物防治资源的筛选显得尤其重要。本研究通过平板对峙实验、分子鉴定、刚果红染色、葡聚糖酶基因克隆与序列分析等方法获得一株抑制多种植物病原真菌的芽孢杆菌,编号为YW26。16S rDNA基因序列分析表明该菌株为解淀粉芽孢杆菌;刚果红染色显示该菌株具有很强的产纤维素酶能力;根据GenBank数据库中芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(CP000560)序列设计引物,克隆得到1527 bp的片段,经测序、BLAST分析显示该片段与Bacillus amyloliquefaciens FZB42内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列同源性为99%。该解淀粉芽孢杆菌抑菌效果显著,具有较强产纤维素酶能力。因此,该菌株可作为一种生防资源,开发新的生防制剂。     

枯草芽孢杆菌TR21对香蕉抗病相关酶活的诱导作用

为筛选能显著诱导香蕉抗病相关酶活变化的枯草芽孢杆菌TR21（Bacillus subtilis）发酵液组分,并探讨其诱导香蕉抗病性机理,选择多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）作为植物抗病性反应指标,采用灌根接种法,研究1株在大田对香蕉枯萎病具有良好防效的枯草芽孢杆菌TR21发酵液不同组分对香蕉根系内3种酶活性的影响。结果表明,接种TR21发酵液、菌体、上清和NB培养基后,香蕉根系内PPO、POD和PAL活性均比无菌水对照高,且都出现2次高峰,PPO、POD活性峰在接种后第3天和第7天出现,PAL活性峰则在接种后1天和5天时出现。比较不同组分接种处理诱导产生的酶活性强弱发现,接种TR21发酵液、菌体的3种酶活性均明显高于接种上清和NB的处理。可以判断TR21发酵液中主要有效诱导组分为菌体。灌根法接种TR21菌体后测定香蕉叶片中3种抗病酶的活性表明,菌体处理后叶片中PPO、POD和PAL活性均显著高于接种无菌水的对照,推测诱导系统抗性可能是TR21菌株防治香蕉枯萎病的机制之一。     

用SSR标记鉴定水稻突变体杂交F1的研究

DNA标记技术可从基因组水平上鉴定F1。用SSR标记鉴定水稻突变体杂交F1,为F2群体构建和突变体基因定位提供依据。以经EMS诱导获得的R30白化突变和‘泸恢17’窄叶突变分别作为亲本,组配2个杂交组合,用3个SSR标记对其单株进行鉴定。RM6105检测了R30白化突变ב泸恢17’组合4个单株（1~4号）,其中4号单株表现父母本互补的带型,为真实F1,另外3个的标记型与母本相同,为母本自交结实,RM6965和RM5349的鉴定结果与RM6105一致;该3个标记从R30ב泸恢17’窄叶突变组合14个F1单株中（5~18号）检测到3个真实F1（9、12和15号）;RM6965、RM5349和RM6105均可对R30与‘泸恢17’组合F1进行鉴定,且结果一致;分子标记对F1进行鉴定,可用于杂交育种。     

茄属植物化学成分及其活性研究进展

总结了茄属植物生物碱类、 甾类、 黄酮类化学成分及其抗肿瘤性、 抗病毒、 抗真菌、 抗炎镇痛、 降低心血管疾病、 灭螺及营养作用生物活性研究进展, 并对其研究前景进行了展望。     

兔出血症病毒的鉴定及其系统发育分析

为确定临床家兔的死亡病因并对其病原进行研究分析,本试验通过临床症状、剖检变化和RT-PCR技术以及HA-HI试验对一起家兔的慢性死亡进行了诊断。结果表明：为兔出血症病毒感染引起的兔瘟。然后设计引物对该病毒的唯一结构蛋白VP60衣壳蛋白的全基因序列进行了RT-PCR扩增、测序和比对分析。结果显示：引起本次家兔死亡的兔出血症病毒的VP60长度与其他已知毒株一致,也是由1740个碱基组成,与已发表毒株的VP60的同源性达90%以上;在系统进化上与俄罗斯2009年的一个流行毒株同源性最高(98.1%)。本试验研究结果表明本次引起非典型兔瘟的兔出血症病毒仍然具有较高的保守性,但病毒的结构蛋白也发生了一些小的变异,这些变异成为基因亚群划分的依据。     

一株高耐铜真菌的分离鉴定及其在茶园土壤中

为了筛选并鉴定一株耐铜富铜菌株并用于环境中重金属铜的清除,从有一定圈养时间的生猪养殖场周围土壤中,运用微生物筛选的方法广泛分离筛选耐铜微生物,再反复分离纯化筛选目标菌株,对其进行了形态和分子鉴定,在400倍光学显微镜及扫描电镜下进行形态特征观察,并将基于5.8S rDNA通用引物扩增的测序片段在GenBank数据库中使用BLAST工具进行比对。得到10株不同耐铜浓度的真菌菌株,其中耐性最高的菌株A4,其耐铜浓度达到940 mg/L。A4菌在察氏琼脂培养基上生长迅速,综合确定该菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。菌株A4对茶园土壤中的铜有一定吸附作用。     

不同磷水平对雷竹幼苗根系形态、酸性磷酸酶活性的影响

为了解不同磷水平下,雷竹幼苗根系形态和酸性磷酸酶活性的变化,以无性繁殖的雷竹苗作为试验材料,采用砂培试验方法,研究不同磷水平(0,0.5,5,50,500 mg/L)对雷竹幼苗的根系形态、酸性磷酸酶活性的影响。结果表明,随着磷浓度的增加,雷竹幼苗的根冠比呈逐渐降低趋势,添加磷素促进有机物在地上部分的积累,从而降低了根冠比值;0.5 mg/L处理时,根系长度达最大值1344.76 cm/株,根表面积和根体积在0 mg/L处理下均达最大值,分别为384.28 cm2/株和11.67cm3/株;在0~5 mg/L磷浓度范围内,雷竹幼苗叶片和根尖酸性磷酸酶(Apase)活性随供磷水平的升高而降低,无磷处理时,叶片和根尖Apase活性均达到最大值,分别为14.44 μmol/(g?min)和11.46 μmol/(g?min)。这表明雷竹幼苗根系形态的变化和酸性磷酸酶活性的增强,可能都是其对低磷环境的一种适应性反应。     

苜蓿多糖对小鼠淋巴细胞增殖和NK细胞活性影响的研究

为了探讨苜蓿多糖对小鼠免疫功能的影响,从苜蓿中提取苜蓿多糖,通过体外苜蓿多糖对淋巴细胞增殖和NK细胞活性影响的研究,初步确定其免疫调节活性。采用MTT法,检测苜蓿多糖对正常Balb/c小鼠体外脾淋巴细胞增殖的影响和NK细胞对K562细胞杀伤活性的影响。结果表明：苜蓿多糖可以单一激活促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,可以协同ConA刺激T细胞增殖,或协同LPS刺激B细胞增殖,提示苜蓿多糖能够调节机体的细胞免疫和体液免疫功能;苜蓿多糖可以显著地增强NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性,提示苜蓿多糖能显著地增强机体非特异性免疫功能。因此,说明苜蓿多糖具有很好的免疫调节效果。