兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。     

携带口蹄疫病毒B细胞表位的兔出血症病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究

为了研究RHDV病毒样粒子作为载体提呈外源B细胞表位的能力,以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体,构建携带FMDV B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa)的VP60嵌合蛋白,研究外源基因对VP60蛋白的表达、病毒样颗粒(VLPs)的装配及免疫原性的影响。分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入外源B细胞表位(FMDV VP1 B细胞表位200~213aa),得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。经IFA、SDS-PAGE和Western Blot方法鉴定嵌合蛋白的表达,通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力,通过动物试验研究其免疫原性。结果显示,嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,可自聚形成病毒样颗粒,免疫小鼠后可以产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。该研究为嵌合VP60 VLPs的形成及结构功能的研究奠定基础,同时为RHDV-VLPs作为外源B细胞表位展示载体的可行性提供依据。     

兔病毒性出血症的诊断要点与综合防治

<正>兔病毒性出血症俗称兔瘟,是由兔病毒性出血症病毒引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病。1989年世界动物卫生组织将该病正式列为B类传染病,我国将其列为二类传染病。一、诊断要点1.家兔中,长毛兔最易感染,2月龄以上的青年兔和成年兔也易感染,40日龄以下仔兔和部分老龄兔不易感染。该病一年四季均有发生,春、秋季发病率相对较高,北方地区一般发生于冬春寒冷季节,夏季少见。在新疫区或未接种疫苗的兔场一旦发病,死亡率极高。     

百脉根高频再生体系的建立及兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的转化

以MS为基本培养基,通过调整激素种类与浓度等培养条件,按正交试验设计的原则,建立了百脉根高频再生体系.结果表明MS 2,4-D 2.0 mg/L KT 2.0 mg/L 培养基可高效诱导愈伤组织的形成,MS 6-BA 1.0 mg/L NAA 0.1 mg/L 培养基可高效诱导芽的分化,MS NAA 0.1 mg/L 培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株.通过构建植物表达载体VP60-pBI121,研究了根癌农杆菌介导的兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60基因对百脉根遗传转化的影响因素,建立了百脉根快速高效遗传转化体系,结果表明,以农杆菌LBA4404为介导菌株、以下胚轴为外植体,预培养3 d,在OD600为0.6的菌夜中浸染20 min,共培养3 d,以及300 mg/L 羧苄青霉素脱菌浓度和50 mg/L 卡那霉素筛选浓度为最佳转化条件.为利用百脉根生产动物口服型疫苗建立了技术基础.     

水貂肠道酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

了获得水貂专用的有益菌种,以为研究毛皮动物益生菌制剂提供理论基础。从健康水貂的肠道中分离纯化出2株酵母菌,编号为JM1和JM2,进行了形态学观察、生理生化试验以及26S rDNA基因序列分析,并构建了系统发育进化树,同时对其生长情况和安全性等进行了综合鉴定。传统鉴定方法和26SrDNA D1/D2区序列分析结果表明：JM1为弗比恩毕赤酵母,菌株JM2为酿酒酵母;生长情况结果表明：2菌株在14~30 h生长较快,在30~40 h生长趋于平稳;2菌株培养液中糖度12 h时波美度开始急速下降,并且在26 h后有升高趋势;安全性试验显示：2菌株对小鼠均无毒性,且在2.73×107cfu/mL时小鼠生长速度最快。     

中国黄麻炭疽病病原菌的分离鉴定及系统发育分析

炭疽病是严重影响黄麻纤维产量和品质的主要真菌性病害,明确炭疽病病原菌种类并测定其致病力有助于黄麻抗病育种和优异抗病基因资源挖掘。本研究从福建省福州市、福建省漳州市、河南省信阳市、安徽省六安市、浙江省杭州市、广西省南宁市和湖南省长沙市等7个黄麻生产区采集黄麻炭疽病病原菌样本,分离纯化出92个菌株;rDNA-ITS区域的序列分析表明,其中11个为典型炭疽病病原菌。LSU区域的系统进化树和形态学特征鉴定显示,ZZ4、GX19等10个菌株为胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides),菌株CS3为黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)。人工接种的致病力测定表明,不同炭疽菌菌株致病力存在显著差异,其中胶胞炭疽菌菌株GX19致病力最强,表现为优势菌株。这些结果为黄麻炭疽病抗性基因位点挖掘和有效防治奠定了基础。     

粗毛纤孔菌形态学鉴定及ITS序列系统发育分析

2008年于哈尔滨城市林业示范基地采取水曲柳树干着生木材腐朽菌子实体,形态学鉴定为粗毛纤孔菌（Inonotus hispidus）。设计纤孔菌属（Inonotus）真菌ITS特异引物,并进行PCR扩增,扩增产物长500bp。扩增产物测序结果与其它10种纤孔菌属真菌ITS序列构建系统发育聚类树。聚类结果表明粗毛纤孔菌与辐射状纤孔菌亲缘关系近;I. circinatus与I. tomentosus亲缘关系近;薄皮纤孔菌与芮克纤孔菌亲缘关系近;I. dryophilus与I. rheades亲缘关系近。I. circinatus、I. tomentosus、粗毛纤孔菌以及辐射状纤孔菌聚为一族;薄皮纤孔菌、芮克纤孔菌、斜生纤孔菌以及I. glomeratus聚为一族;I. dryophilus、杨生核纤孔以及柽柳核纤孔菌聚为一族。     

南欧大戟叶绿体基因组特征及其系统发育分析

为探究南欧大戟(Euphorbia peplus L.)叶绿体基因组序列特征及系统进化位置关系。本研究以南欧大戟总DNA为研究对象,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序仪测定南欧大戟的叶绿体基因组序列,采用GetOrganelle进行完整叶绿体基因组的组装,并借助生物信息学工具进行基因组的注释分析、图谱构建和系统发育分析。结果表明,南欧大戟叶绿体基因组全长159 466 bp,呈典型的四分体环状结构,包括一个大单拷贝区、一个小单拷贝区和两个反向互补重复区,其大小分别为89 398、17 802和26 133 bp,GC值为35.8%;共编码基因130个,其中包括8个rRNA基因、37个tRNA基因和85个蛋白编码基因。基于23种植物系统发育分析结果表明,南欧大戟与同亚科植物浆果乌桕的亲缘关系最近。本研究获取了南欧大戟的叶绿体基因组特征信息和系统发育位置,为该植物的资源开发、品种鉴定和遗传进化研究提供了新的材料基础。     

猪的GAD2基因的克隆及其系统发育的分析

通过RT-PCR克隆和测定了猪的谷氨酸脱羧酶-2(Glutamic acid decarboxylase 2, GAD2)基因的核苷酸序列并构建了该基因编码蛋白的三维结构分子模型。结果显示猪的谷氨酸脱羧酶-2基因的核苷酸长度由1758bp个碱基组成,编码产物为由585个氨基酸残基组成的多肽,编码产物中含有5-磷酸吡哆醛互作的结构域。构建包括共19物种的系统进化树,所得数据有利于我们了解谷氨酸脱羧酶趋同和趋异的进化途径。     

抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

为对猪瘟病毒(CSFV)建立更加有效的临床检测方法.用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合.经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体(McAb)为IgG1(G9,4E8)和IgG2a(C7.C9,G10)亚类.经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1:1 600～1:3200,腹水效价为1:51200～1:102400.交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒(CSFV)抗原决定簇,具有高度特异性.稳定性试验表明,制备的杂交瘤细胞株经连续传代25代和经3次冻存复苏后,仍能稳定分泌特异性抗体.抗CSFV McAb的成功制备,为进一步研究CSFV的生物学特性及其快速诊断方法的建立奠定了基础.     

丽水不同等级降水日数多时间尺度变化特征

为了了解不同等级降水日数变化特征,更好地为农业生产服务,根据丽水市1953-2011年逐日降水量资料,在对不同等级降水日数进行年、月趋势分析的基础上,运用Mann-Kendall检验对显著降水事件进行趋势变化和突变转折的研究,从而探讨不同等级降水日数在多时间尺度上的变化特征。结果表明：近59年来,丽水市总降水日数呈明显的下降趋势,气候倾向率达到-3.70 d/10 a,其中小雨日数占总雨日的72.6%,下降趋势同样通过99%显著性检验。暴雨日为缓慢增加态势,其他等级降水日数表现为减少,但不显著。Mann-Kendall检测得出：雨日表现为“先增加,后减少”的变化趋势,2002年是雨日由缓慢减少转为急剧下降的突变点。     

O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因在哺乳细胞中的表达

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)蛋白酶3C基因的真核表达质粒,并在BHK-21细胞中进行表达,以RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因,利用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶将3C基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),通过脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1(-)-3C。PCR,双酶切鉴定及测序结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C构建成功;Western-blot分析结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C在BHK-21细胞中能够表达O型FMDV蛋白酶3C基因。该真核表达质粒的构建,为进一步研究O型口蹄疫空衣壳的体外组装以及O型口蹄疫空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。     

鸭感染禽坦布苏病毒血清学的检测与分析

为了解中国鸭群感染禽坦布苏病毒流行病学的情况,采用建立的间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）对于2010年6月—2013年9月三年内采自福建、江西、浙江、广东、广西五省（区）发生产蛋异常鸭场的各品种开产种（蛋）鸭、后备种（蛋）鸭及肉鸭血样共6854份进行禽坦布苏病毒抗体的检测,并对结果进行了分析。结果表明：开产种（蛋）鸭、后备种（蛋）鸭及肉鸭中除肉用番鸭血清中未检出禽坦布苏病毒抗体外,其他品种鸭血清中禽坦布苏病毒抗体阳性率高低不一,揭示存在不同程度的禽坦布苏病毒感染,且感染谱扩大到肉鸭,为以上省（区）乃至中国鸭群需做好禽坦布苏病毒感染的预防提供了科学依据。     

桑花叶型萎缩病病原的检测与序列分析

旨在获得安康地区桑花叶萎缩病病原序列,为桑花叶萎缩病的防治提供更多的信息。用RT-PCR技术对安康地区染花叶型萎缩病病株的病原进行了分离,克隆测序并在Mfold网站预测其二级结构。该病的病原为桑花叶萎缩类病毒MMDVd-201110151（GenBank登录号：JQ809700）,核苷酸长度357 bp,GC含量50.7%,219 bp后38个碱基与樱桃小圆形类病毒样核糖核酸具有约85%的一致性。Mfold网站预测二级结构有58.3%的碱基配对,两端为分枝状结构。成功分离到安康地区桑花叶型萎缩病病原。     

福建黄兔免疫功能低下模型的建立

为了探索一种简便易行、具有良好应用性并适用于中医药领域免疫功能低下的动物模型,以及为福建黄兔提供一种新型实验动物的实验依据。实验采用氢化可的松为细胞免疫抑制剂,6个实验组,其中1个对照组,5个剂量组（分别每天20、25、30、35、40 mg/kg）,采用流式细胞检测法测CD4、CD8细胞含量,并通过摘取脾脏的方式计算脾脏指数。实验结果显示：B、C剂量组（分别每天25、30 mg/kg）的福建黄兔在注射药物前后CD4、CD8细胞含量呈现明显的下降趋势,证实上述2个剂量组是福建黄兔免疫功能低下模型造模的较好剂量;同时,A~E剂量组的黄兔脾脏相较于对照组均呈现不同程度的缩小,脾脏指数降低,B、C、D组与对照组差异显著,反映其免疫功能受损,其中尤以C剂量组(30 mg/kg)下降最为明显。由此可见,C剂量组是本实验中免疫功能低下动物模型造模的最适宜剂量。     

南方水稻黑条矮缩病毒S9片段基因编码产物的生物信息学分析

预测南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) S9片段编码蛋白的功能,为进一步深入分析相关基因编码产物的功能提供理论依据。应用RT-PCR克隆了SRBSDV云南芒市分离物(SRBSDV-YNMShi)的S9片段,测定其全序列,并对S9及其编码蛋白进行生物信息学分析。结果表明,S9片段全长1900 nt,编码P9-1和P9-2 2个蛋白。S9核苷酸序列与广东、海南、湖北分离物的同源性分别为99.5%、99.1%和98.7%。系统进化分析再次印证了SRBSDV是斐济病毒属的成员,SRBSDV-YNMShi与广东、越南分离物聚成一枝,与海南分离物有一定的进化分离趋势。P9-1为一个不稳定疏水蛋白,亚细胞定位于细胞核内,无规则卷曲是该蛋白质的主要结构元件,与其亲缘关系最近的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)有着类似结构。P9-2是有2个跨膜结构域的亲水性稳定蛋白,亚细胞定位于质膜,α-螺旋是其主要结构元件,有1个保守的G蛋白偶联受体。P9-1可能为SRBSDV复制的关键因子,P9-2可能为膜蛋白,具有转运的功能。     

鸭IGF-IR基因部分序列克隆、鉴定及在胚胎期胸肌组织中的差异表达分析

为了克隆分析鸭IGF-IR基因部分的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。通过同源性比对,克隆了IGF-IR基因cDNA部分片段,并运用生物信息学方法分析了不同物种序列进化关系,运用荧光绝对定量PCR技术检测了IGF-IR mRNA在肉用型品种高邮鸭和蛋用型品种金定鸭胚胎期不同发育时期胸肌中的表达。序列分析结果表明：克隆得到的鸭IGF-IR基因cDNA270 bp片段长度,其核苷酸序列与鸡、人、小鼠、大鼠、猪、牛的IGF-IR基因相应核苷酸序列的同源性分别为95%、79%、78%、77%、78%、76%;荧光绝对定量结果表明：IGF-IR基因在胸肌中呈“波浪形”表达,在21胚龄表达量最高,与17、25、27胚龄和7日龄差异显著(P<0.05);IGF-IR基因在品种间表达量除21胚龄时差异显著外(P<0.05),其余各胚龄差异均不显著(P>0.05),表明IGF-IR mRNA的表达在所研究品种胚胎期的胸肌中相对稳定。     

牛IL-6基因原核表达及其对口蹄疫病亚单位疫苗的佐剂效应研究

为了研究荷斯坦奶牛白介素6(IL-6)基因作为佐剂对VP1蛋白免疫效果的影响,分别克隆IL-6基因和VP1基因,连接到载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1/BoIL-6、pGEX-6P-1/VP1、pGEX- 6P-1/BoIL-6/VP1。重组质粒在大肠杆菌RS21中高效表达,动物试验检测IL-6作为分子佐剂对豚鼠免疫应答的影响。结果表明：构建的重组质粒在原核系统中正确表达,以包涵体形式存在。表达的融合蛋白三次免疫豚鼠后,检测发现IL-6/VP1组能够诱导产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应,与疫苗组及VP1+FCS组免疫效果相当。本实验证实IL-6作为分子佐剂能够提高VP1的免疫效果。     

芽孢杆菌E-1的鉴定及其抑菌活性

从云南昆明市郊不同地点紫茎泽兰根际分离细菌,经平板对峙培养筛选出一株抑菌能力较强的菌株,命名为E-1。通过菌株的培养性状、常规生理生化特性和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析,鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册,登录号为JN648100。对E-1与供试的5株植物病原细菌和5株病原真菌进行对峙试验。结果显示：E-1对土传病原细菌和真菌都有不同程度的拮抗作用,是较好开发潜能的生防菌株。