牛卵泡卵母细胞体外受精和发育的研究

利用屠宰黄牛卵巢作为供试材料 ,对卵巢表面 2～8mm卵泡卵母细胞体外受精(IVF) -受精卵的体外发育 (IVD)进行了系列研究 ,采用上游法、Percoll法和本实验室沿用的直接洗涤法处理牛冻精 ,观察 3种精子处理方法处理牛冷冻精子对卵母细胞体外受精胚胎发育的影响。实验结果 ,就卵裂率指标 ,采用Percoll法处理的精子进行卵母细胞体外受精 ,和上游法及洗涤法分别比较 ,差异均不显著 (P >0 .0 5 ) ;桑囊率指标 ,只有上游法比洗涤法高 ,差异显著 (P <0 .0 5 ) ,其余差异均不显著。以FERT -TALP液作为受精液采用常规培养方法 ,精卵作用 18～ 2 0h后分开 ,与精卵作用 6～ 8h后分开卵母细胞受精后的 8-细胞发育率及桑囊率变化不大 (P >0 .0 5 ) ;卵裂率指标 ,18～ 2 0h处理组高于 6～ 8h处理组 ,但两组之间差异也不显著。表明 ,在生产中采用FERT -TALP液做为受精液 ,应用上游法处理精子 ,不需要另购试剂 ,精卵孵育时间由 18～ 2 4h缩短至 6～ 8h是可行的 ,其现实意义是可以简化胚胎体外生产的程序 ,节省人力 ,降低成本     

影响牛卵母细胞体外成熟的因素

本文就牛体外受精的关键环节之一体外成熟,阐述了卵母细胞质量、培养基、激素、生长因子、血清、卵泡液及颗粒细胞对其的影响。     

成熟培养基中添加卵泡液对牛体外受精卵发育的影响

从牛屠体卵巢采得卵母细胞后，置于ＣＯ２培养箱中作２４小时成熟培养。在成熟培养液中分别添加０％、１０％、２０％、３０％牛新鲜卵泡液９ＢＦＦ）或灭活卵泡液（ｈＢＦＦ）。分层Ｐｅｒｃｏｌｌ液将解冻精子离心洗涤后，悬浮于含有１０μｇ／ｍｌ肝素的修正Ｔｙｒｏｄｅ液滴中，将培养成熟的卵子移入后作授精培养。２０小时后，固定、染色一部分卵子，镜检其受精情况，其余卵子移入发生培养基与颗粒膜细胞作混合培养。试验结果表     

牛卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵泡大小、卵泡液和卵丘细胞对牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响。结果表明 :直径 2～ 6mm卵泡中的卵母细胞成熟率 ( 72 1%)最高 ,与直径小于 2mm( 5 8 4%)、6～ 8mm( 5 6 4%)及大于 8mm ( 3 5 0 %)卵泡中的卵母细胞组差异显著 ;成熟培养基中添加 10 %的新鲜牛卵泡液 (bFF)对牛卵母细胞的体外成熟有促进作用 ,但高浓度的bFF( 2 0 %、3 0 %)则抑制牛卵母细胞的体外成熟 ;卵丘 -卵母细胞复合体的质量影响卵母细胞的体外成熟 ,A、B、C三级卵母细胞成熟率分别为 86 1%、66 3 %、3 5 6%,卵裂率分别为 42 8%、3 1 9%、10 5 %,差异均显著 (P <0 0 5 )。     

牛性机能发育阶段与卵泡、黄体因素对卵母细胞

利用屠宰母牛卵巢,对来自不同性机能发育阶段母牛的卵巢卵母细胞、不同状态卵巢卵泡的卵母细胞的体外成熟（ＩＶＭ）、体外受精（ＩＶＦ）进行了系列研究。结果表明,来自初情期、性成熟母牛卵巢的卵母细胞受精后的卵裂率（７４．７％和８１．５％）、囊胚率（２３．０％和２６．８％）显著高于来自初情期前母牛卵巢卵母细胞的卵裂率（１８．８％）和囊胚率（１．８％）Ｐ〈０．０５;有黄体卵巢的卵母细胞体外受精后的发育能力显著     

牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立

研究不同犊牛血清浓度、培养时间和不同类型血清对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,添加体积分数为10%,15%和20%的FBS时,各组间卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养时间为16h时卵母细胞成熟率与培养时间为20h和24h时的差异极显著(p<0.01),而培养时间为20h和24h时卵母细胞成熟率差异不显著(p>0.05);培养基添加OCS对卵母细胞成熟的影响效果与添加FBS的无显著差异(p>0.05),二者的卵母细胞的核成熟率均达到80%以上。     

卵泡大小对牛卵母细胞体外成熟影响的研究

研究了牛不同大小卵泡 ( 2～ 4mm、 4～ 6mm、 6～ 8mm、 >8mm )中的卵母细胞的体外成熟及随后的发育能力。直径 2～ 4mm、 4～ 6mm、 6～ 8mm组的体外成熟率 ( 6 0 8% ,6 5% ,6 1 7% )显著高于直径 >8mm组 ( 35 1 % ) ;体外受精后的发育能力在 2～ 4mm、 4～ 6mm组显著优于 6～ 8mm、 >8mm组     

牛卵母细胞体外成熟和体外受精技术

本文综述了十几年来牛的卵母细胞体外受精和体外成熟技术的研究进展，包括精子的体外获能、卵母细胞采集受成熟培养和体外受精、体外受精早期胚胎的培养等环节，并且对影响该技术的王要原因进行了分析，对体外受精在家畜育种中的应用提出了展望。     

不同因素对牛卵母细胞体外成熟培养效果的影响

文章主要从采集方法、性周期阶段以及培养液中FBS浓度3个方面对牛卵母细胞体外成熟的影响进行了分析。结果表明：①不同采卵方法的采卵效果存在差异,但成熟培养和体外受精情况差异不显著（P〉0．05）;②从卵泡期和黄体期卵巢采集到的卵母细胞的体外成熟率和卵裂率分别,为59.7%,56．6％和39．5％、36．6％,没有显著差异（P〉0．05）;③培养液中添加20％FBS组的卵母细胞成熟率和卵裂率显著高于10%FBS和30%FBS组（P〈0．05）.     

透明质酸对牛卵母细胞体外成熟影响的研究

在改良的基础培养液中添加HA,主要探讨HA对牛卵母细胞成熟的影响。结果表明,当mTCM-199中HA浓度为3．0 mg/mL时,第一极体排出率和卵裂率显著高于其他各组 (P<0．05),初步表明3．0 mg/mL是无血清培养中HA的最佳浓度。当在mTC-199中添加 HA、BSA和OCS时,OCS组的第一极体排出率显著高于其他两组(P<0．05),分别为 83．40％、84．33％和92．17％,但HA组与BSA差异不显著(P>0．05);卵裂率三者差异均不显著(P>0．05);表明在无血清培养中HA可代替BSA,但是培养的效果不如血清。HA在 mTCM-199和mSOF基础培养基中,对卵母细胞的第一极体排出率和卵裂率无明显差异(P >0．05)。表明在无血清培养下,HA在复杂和简单的培养液中都支持卵母细胞的成熟。     

牛卵泡卵体外成熟及其受精能力的研究

本试验主要研究了牛卵泡卵体外成熟、体外受精及其受精过程的发生。从屠宰场收集800枚牛卵泡卵进行体外成熟培养,并用体外获能的精子体外受精。在用m-TCM199培养21、22、24、26、28h后,达到中期Ⅱ的卵母细胞比例分别为33.89％、74.16％、77.78％、86.67％、85.71％;25h后,如果继续培养,成熟的卵母细胞比例不再显著增加。卵母细胞的自身形态显著地影响其成熟效果,A、B、C级卵培养24h后分别有94.60％、55.43％、31.25％的卵母细胞达到中期Ⅱ。卵泡卵在体外滞留8h后,其成熟率(47.11％)明显地低于45min(77.92％)或4h(74.60％)。肝素和钙离子载体A 23187都能诱发牛精子获能,二者在受精效报上差异不显著(P>0.05),并且都有多精入卵现象发生。授精后6h精子进入卵内,精子入卵后2～3h头部膨大,6h后出现早期原核,最早发生卵裂是在授精后30h。     

发育阶段对牛卵泡卵母细胞冷冻效果的影响

研究了用3种不同方法（A法：程序冷冻法：B法：超快速冷冻法；C法：玻璃化冷冻法）冷冻保存的牛GV期和IVM卵母细胞的发育潜力，结果表明，无论采取哪种方法。GV期卵母细胞的发育潜力均显著低于IVM卵母细胞。三种冷冻方法中，以玻璃化冷冻为最佳。     

牛卵泡卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

对用３种不同方法（Ａ法：１．０ｍｏｌ／Ｌ甘油平衡，从２０℃开始以１℃／ｍｉｎ的速度降至－℃，植冰，１０ｍｉｎ后以０．３℃／ｍｉｎ降至－３０℃，再以０．１℃／ｍｉｎ降至－３３℃，投入液氮；Ｂ法：１．６ｍｏｌ／Ｌ丙二醇＋０．ｌｍｏ１／Ｌ蔗糖平衡，５℃冰箱中保存１５ｍｉｎ，从Ｏ℃开始按Ａ法中的程序降温；Ｃ法：即玻璃化法）冷冻保存的牛ＧＶ期卵母细胞的发育潜力进行了研究。解冻后，Ｃ组卵母细胞形态正常率显著高于Ａ、Ｂ两组。３种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后，平均卵丘扩展率为６０％，其中Ｃ组最高（６９．９％）。卵丘扩展的卵母细胞中，７９．３％发生ＧＶＢＤ，但大多数没有达到ＭＩ期。３组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率分别为１４．２％、８．３％、２０．０％和１０．０％、７．１％、１２．１％，其中Ａ组中有１枚卵裂。     

玻璃化冷冻牛卵母细胞单精子注射后体外发育能力的研究

实验研究了不同成熟培养时间的牛卵母细胞玻璃化冷冻及胞质内单精子注射(ICSI)后的受精效果。结果表明:成熟后的新鲜牛卵母细胞按照ICSI注射方法穿刺而不注射精子组与未经穿刺的对照组相比,孤雌激活后的卵裂率、囊胚发育率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05);成熟培养16h(MⅠ)和23h(MⅡ)卵母细胞冷冻解冻后形态正常率均显著低于新鲜对照组(76.66%、87.33%vs100.0%)(P<0.05),冷冻解冻后二者分别成熟培养至24h,ICSI后胚胎的囊胚发育率(5.29%、14.41%)显著低于新鲜对照组(24.40%)(P<0.05);成熟培养23h与成熟培养16h的卵母细胞冷冻解冻后形态正常率及ICSI后囊胚发育率(14.41%vs5.29%)均有显著性差异(P<0.05)。实验证明,ICSI操作不会影响卵母细胞发育潜力;玻璃化冷冻影响卵母细胞解冻后形态正常率以及ICSI后胚胎的发育能力;成熟培养23h比16h的卵母细胞冷冻保存后经ICSI的胚胎发育潜力高。     

影响卵母细胞体外成熟的因素

卵母细胞是胚胎工程技术研究中最为重要的一种试验材料,卵母细胞的体外成熟(maturation in vitro,IVM)可以为用体细胞核移植的方法生产大型转基因动物的研究提供大量MⅡ期卵母细胞，同样也是动物体外受精技术的关键环节。作者就卵母细胞体外成熟的影响因素做了简要的论述，主要介绍了卵母细胞来源、其培养系统、激素和生长因子等因素对卵母细胞体外成熟的影响。     

亮甲酚蓝染色法筛选卵母细胞对牛体细胞克隆胚体外发育的影响

为探索用亮甲酚蓝染色法筛选卵母细胞是否有利于牛体细胞克隆胚的体外发育,将采集的卵母细胞分成3组:对照组,采集后的卵母细胞直接放入成熟液培养,不用亮甲酚蓝处理;控制对照组,卵母细胞于PBS 中放置90 min后放入成熟液中培养;试验组,将采集的卵母细胞在含有26 μmol/L亮甲酚蓝的PBS中放置90 min.然后将处理过的卵母细胞根据着色情况分为两组,即BCB+(胞质呈蓝色,成熟卵母细胞)和BCB-(胞质未着色,生长期卵母细胞).各组卵母细胞24 h体外成熟培养,统计各组卵母细胞成熟率.分别用成熟后的各组卵母细胞用于细胞核移植,统计体细胞核移植的卵裂数、囊胚数和囊胚细胞数.结果表明,BCB+组卵母细胞的成熟率明显高于BCB-组卵母细胞的成熟率(74.0%,53.4%),差异显著(P<0.05).BCB+组的囊胚率(45.0%)与对照组、控制对照组和BCB-组的囊胚率(34.9%,36.4%和5.2%)相比差异显著(P<0.05).另外BCB+组的囊胚细胞总数(114.5±7.5)较其他组差异显著(P<0.05).表明通过亮甲酚蓝染色法筛选出成熟的高质量牛卵母细胞用于体细胞核移植,可以获得更高的克隆囊胚率.     

血管内皮生长因子对绵羊卵母细胞体外成熟及体外受精卵卵裂率的影响

试验研究了在绵羊体外成熟和体外受精培养系统中分别添加5ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精卵的早期发育的影响。结果表明:①与对照组相比,添加5ng/mLVEGF能够显著(P<0.01)提高绵羊卵母细胞的体外成熟率。②在体外受精液中添加5ng/mLVEGF能够显著(P<0.05)提高成熟卵母细胞的卵裂率。研究表明,VEGF对绵羊卵母细胞的体外成熟和受精具有调节作用。