性腺激素对山羊子宫内膜细胞TNF-α与TGF-β分泌活性的影响

为探讨性腺激素对山羊子宫内膜细胞分泌活性的影响,基于套皿培养技术构建永生化山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)与基质细胞(ESC)共培养体外研究模型,通过ELISA检测性腺激素E2和/或P4对单独培养EEC中TNF-α与TGF-β分泌活性的调节作用以及ESC对该培养体系的影响.结果显示:与未加激素对照组相比,单独或混合添加E2和P4均可显著增加单独培养EEC向顶端分泌TNF-α水平(P＜0.05),而对细胞基底端TNF-α分泌活性影响不显著;E2单独作用较对照组显著降低EEC向细胞顶端分泌TGF-β水平(P＜0.05),P4单独或与E2共同作用下则主要对单独培养EEC顶端及基底端分泌TGF-p水平具有显著增强作用(P＜0.05).对于EEC-ESC共培养细胞模式,E2和/或P4显著降低EEC顶端和基底端TNF-α分泌水平(P＜0.05);EEC顶端TGF-β分泌水平在E2和/或P4作用下显著降低(P＜0.05),而EEC基底端TGF-β分泌水平不受激素作用所影响.激素对单独培养及与ESC共培养模式下的极化EEC顶端及基底端TNF-α与TGF-β分泌水平的差异,提示ESC对激素作用下山羊子宫内膜上皮细胞分泌方向及分泌水平的重要调节作用.     

山羊子宫内膜基质细胞对上皮细胞IL-18分泌活性的调节作用

为了探究性腺激素作用下山羊子宫内膜上皮细胞（EEC）中白细胞介素-18（IL-18）的分泌活性,以及子宫内膜基质细胞（ESC）对其分泌活性的调节作用。基于套皿共培养永生化山羊EEC和ESC为体外研究模型,通过ELISA和Western blot方法检测E2和/或P4对EEC中IL-18分泌水平的作用以及ESC对该作用的影响。ELISA结果显示,E2较无激素对照组可显著增强单独培养EEC中IL-18的分泌水平（P〈0.05）,P4单独或与E2联合作用则进一步增强其分泌活性（P〈0.01）;EEC与ESC共培养模式下,ESC细胞对性激素作用下EEC中IL-18分泌活性具有显著的抑制作用。Western blot结果显示,在单独培养或与ESC共培养模式下,EEC培养上清液中IL-18均以相对分子质量大小18 300的具有生物活性的蛋白形式存在。本研究结果表明,山羊ESC对性腺激素作用下EEC中IL-18的分泌活性具有重要调节作用。     

不同性腺激素水平对子宫内膜细胞体外增殖的影响

为探讨不同雌激素（E2）和孕激素（P4）水平对家兔子宫内膜细胞体外增殖和分化的影响。采用离心法获取家兔子宫内膜上皮细胞及基质细胞，设不同雌激素和孕激素水平组合添加于培养液，利用MTT法间接测定不同性腺激素水平对子宫上皮和基质细胞的体外增殖的影响；利用免疫组织化学法检测传代细胞是否分化为其他类型细胞。结果表明利用离心法可获得纯度较高的子宫内膜上皮和基质细胞；孕激素（100nmol／L）对基质细胞的增殖有促进作用（P〈0.05），雌激素（100nmol／L）和少量孕激素（10nmol／L）对上皮细胞增殖有促进作用（P〈0.05）；免疫组化结果表明，经性腺激素刺激的子宫内膜上皮和基质细胞分别对上皮角蛋白抗体和波形蛋白抗体呈阳性。研究证实适宜的性腺激素水平对体外培养的子宫内膜细胞有促进增殖的作用，而且不会促使其分化为其他类型细胞。     

NGF对输卵管黏膜上皮细胞促性腺激素受体表达的影响

本研究以牛输卵管黏膜上皮细胞为研究对象,利用荧光定量PCR方法检测NGF和酪氨酸激酶抑制剂K252α对输卵管粘膜上皮细胞膜促性腺激素受体FSHR和LHRmRNA表达的影响.添加30、60、100μg/L NGF可以显著增加FSHR mRNA的表达,添加30和60 μg/L的NGF同样增加LHR mRNA的表达.添加抑制剂K252α后,LHR和FSHR的表达量均比对照组显著下降.该结果说明NGF可以通过其受体调节输卵管黏膜上皮细胞促性腺激素受体FSHR和LHR的表达.     

丹参水提物对山羊子宫内膜上皮细胞炎症模型中基质金属蛋白酶-2表达的影响

为研究丹参水提物(SME)对子宫内膜上皮细胞炎症模型中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响,体外培养山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),利用内毒素(脂多糖,LPS)诱导细胞增殖和产生TNF-α,建立EEC炎症模型。然后给予高、中、低不同剂量SME干预。应用MTT比色法检测细胞活力,ELISA试剂盒检测TNF-α含量,实时荧光定量PCR检测细胞MMP-2mRNA表达变化。结果表明,5μg/mL LPS作用EEC 12h时促增殖作用显著(P0.01);SME可显著促进EEC炎症模型中MMP-2的表达,以中、高浓度组的作用较为明显。说明SME对LPS引起的子宫内膜炎症反应有一定的保护作用。     

类阿片肽对山羊生殖内分泌的调节Ⅱ．吗啡和纳洛酮在体外对促性腺激素的影响

利用含早卵泡期山羊血清或中黄体期山羊血清的培养液，对山羊腺垂体细胞进行２４ｈ体外培养，并在培养液中分别加入阿片受体兴奋剂——盐酸吗啡和其拮抗剂——盐酸纳洛酮，研究了类阿片肽对山羊垂体细胞分泌促性腺激素功能的影响。结果表明，在两种培养条件下，吗啡或纳洛酮对垂体促性腺激素的分泌均无显著影响（Ｐ＞０．０５）。因而认为，在山羊，类阿片肽对垂体细胞促性腺激素的分泌无直接调节作用。     

蛋壳形成过程中部分生殖激素及其受体基因变化规律的研究

为了解蛋鸡产蛋过程中相关激素和受体基因的变化规律,试验采用放射免疫技术(RIA)和荧光定量PCR技术对蛋壳形成过程中血清孕酮(P4)、雌二醇(E2)2种激素含量的动态变化和孕酮受体(PR)、雌激素受体(ERα)在输卵管子宫部的表达进行测定。结果表明:蛋进入子宫前1小时孕酮含量最高,与其他时间点相比差异极显著(P0.01),蛋进入子宫部后孕酮含量逐渐下降,直到产蛋后1小时孕酮含量开始上升;雌二醇含量在蛋进入输卵管子宫部15小时最高,蛋排出时最低,产蛋后1小时开始升高;蛋壳形成过程中PGRmRNA的变化趋势是下降-上升-下降,蛋进入输卵管子宫部15小时PGR表达量较蛋排出时有极显著提高(P0.01),之后PGR表达量开始下降;在蛋壳形成过程中ERα表达量呈先上升后下降的趋势,在蛋进入输卵管子宫部45分钟时ERα表达量最高,与蛋排出时、产蛋后1小时相比差异极显著(P0.01)。     

NTS与TES基因对EEC凋亡调控作用的研究

NTS参与产前代谢和神经系统的早期建立,TES是构成细胞间连接的一部分。该研究主要探究NTS及TES对山羊子宫内膜上皮细胞(EEC)凋亡和凋亡相关蛋白(P38 MAPK和caspase-8)的调节作用。通过构建NTS和TES过表达载体并将其转染至EEC,用流式细胞凋亡检测、Real-time PCR和Western Blot等试验进行检测。结果表明:过表达NTS和TES都对EEC凋亡具有显著抑制作用(P0.05),对细胞凋亡相关蛋白Caspase-8和p38的调控作用相同,增加p38的表达(P0.05),而抑制Caspase-8的表达(P0.01);NTS和TES在EEC中存在负反馈调节作用,在mRNA和蛋白水平NTS过表达显著抑制TES的表达(P0.01),而TES过表达对NTS mRNA表达水平无显著影响(P0.05),但可以显著抑制NTS蛋白水平的表达(P0.05)。     

雌激素和孕酮对犬子宫内膜基质细胞增殖和孕酮受体表达的影响

本试验应用不同消化分离途径获取犬子宫内膜基质细胞,调节培养液中雌激素(E₂)和孕酮(P₄)的浓度,采用MTT法测定E₂和P₄浓度水平对犬子宫内膜基质细胞体外增殖的影响,利用细胞免疫组织化学法鉴定细胞并测定细胞孕酮受体(PR)表达与激素浓度水平的相关性。结果表明,E₂浓度变化(15、30、100 pg/mL)对犬子宫内膜基质细胞的增殖和PR的表达均没有显著的调节作用(P>0.05);P₄(15、30 ng/mL)对犬子宫内膜基质细胞的增殖有显著促进作用(P<0.05),P₄(3、15、30 ng/mL)对犬子宫内膜基质细胞PR的表达具有显著的抑制作用(P<0.05),其影响程度与浓度和作用时间关系密切。     

促性腺激素对输卵管黏膜上皮细胞NGF及TrkA表达影响

利用荧光定量PCR和ELISA技术研究了LH和FSH对输卵管黏膜上皮细胞表达NGF及其受体TrkA的影响.结果显示:FSH能促进NGF及其受体TrkA的mRNA的表达(P＜0.05);LH能促进NGF mRNA的表达(P＜0.05),也能促进TrkA mRNA的表达,但差异不显著(P＞0.05).ELISA结果表明,添加LH和FSH后,NGF的表达量有所增加,但是差异不显著(P＞0.05).这说明促性腺激素LH和FSH对NGF和TrkA的表达有影响.     

生长激素释放因子在CHO细胞的表达

在对生长激素释放因子 (GRF)基因改造和化学合成 ,并构建了其真核表达载体 pc DNA3- GRF(1- 32 )的基础上 ,用 L ipofectin将上述载体转染 CHO细胞进行瞬时表达。提取转染细胞总 RNA,用 RT- PCR和 Dot blotting检测 GRF基因的表达情况 ,用 Western blotting检测转染细胞上清液的表达产物 ,均得到了阳性结果。制备大鼠垂体单层细胞 ,测定表达产物的生物学活性 ,结果表达产物可刺激生长激素释放 ,并且比对照组提高 3.8倍。试验结果表明 ,已构建的真核表达载体 pc DNA3- GRF(1- 32 )能表达出有生物学活性的 GRF。     

猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达

将PCR将增得到pGH基因插入到带有polh启动子和gp67强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP67-A中，构建重组质粒pGP67pGH，并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV-OCC)基因组DNA共转染Sf9细胞，构建出重组病毒AcMNPV-pGP67-pGH-OC^-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS-PAGE和Western blot结果表明，细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为22kDa的猪生长激素特异性反应带，且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些，薄层扫描仪扫描估测可知，重组pGH分别占细胞可溶蛋白的8．98％和培养液上清总蛋白的3.61%。将表达96h的培养液上清浓缩液进行N－糖基化分析，结果显示重组pGH无N－糖基化加工修饰。     

环境激素阿特拉津对家蚕卵巢培养细胞(BmN)凋亡的影响

为探讨利用鳞翅目昆虫对环境激素进行生物学评价和监测的方法,用2,3-二苯基溴化四唑(MTT)、4’,6二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色和单细胞凝胶电泳(SCGE)、流色细胞仪检测(FCM)等技术,分析检测了环境激素阿特拉津(AT)对体外培养家蚕卵巢细胞(BmN)细胞增殖和凋亡的影响。结果显示：AT浓度超过0．0625mmol/L,显著抑制了BmN培养细胞48h的存活率(p＜0．001),LC_(50)为0．0703mmol/L;0．0625～0．5000mmol/L AT处理24h后,BmN细胞核出现明显的凋亡现象;0．5000mmol/L的AT处理48h后,BmN细胞DNA链发生断裂。AT对BmN细胞增殖和凋亡的影响有明显的时间-剂量效应。长期处于AT污染的环境中对鳞翅目昆虫可能有严重的细胞毒性。     

生殖激素对禽类卵泡细胞凋亡的影响

从禽类生殖内分泌角度出发，依据近年来国内外的科学研究资料系统地综述了促性腺激素释放激素（Gonadotropin releasing hormone，GnRH）、促卵泡激素（Folicle-stimulating hormone，FSH）、雌激素（estrogen），孕激素（progestin）、促乳素（（Prolactin，PRL），褪黑素（Mel）、抑制素（Inhibin，IB）对禽类卵泡细胞凋亡的调控，为研究禽类繁殖性能及生殖毒理机制提供科学理论参考。     

环境激素壬基酚对鳞翅目昆虫培养细胞的影响

壬基酚(NP)是一种最新确认的环境激素。为了探讨环境激素对鳞翅目昆虫培养细胞的影响及其利用途径,研究了NP对家蚕卵巢细胞(BmN)和苜蓿丫纹夜蛾卵巢细胞(Sf9)的影响。在TC-100培养液中添加NP,体外培养细胞,MTT法调查细胞增殖,抽提细胞DNA进行损伤调查。结果表明,0.032 mmol/L以下浓度的NP对BmN细胞增殖有促进作用(p<0.01),NP浓度继续增加则出现毒害,细胞生长和增殖受到抑制(p<0.01),死亡细胞明显增加,具有浓度效应和时间效应。NP对BmN培养细胞的LC50(72 h)为0.051 mmol/L。浓度超过0.128 mmol/L时,能诱导BmN细胞DNA链发生断裂,导致DNA损伤。NP对Sf9细胞增殖有较强的抑制作用(p<0.01),有明显的浓度效应和时间效应,培养72 h时LC50为0.047 mmol/L;在试验浓度范围内,细胞生长和增殖虽然受到抑制,但死亡细胞并无明显增加。NP对鳞翅目昆虫培养细胞的生长发育具有显著影响,有诱发DNA损伤的可能。     

促卵泡素对鸡等级前卵泡细胞发育的影响

实验研究了鸡等级前卵泡颗粒细胞和膜细胞的发育及促卵泡素(FSH)对其增殖的调控作用。形态学观察显示小白卵泡只有1层颗粒细胞,大白卵泡出现2层颗粒细胞,而小黄卵泡和大黄卵泡中则有多层颗粒细胞。结果表明:卵泡颗粒细胞和膜细胞的密度和细胞层厚度随着卵泡发育的等级而增加。卵泡体外悬浮培养表明,FSH显著刺激小黄卵泡和大黄卵泡中颗粒细胞的增殖,但对膜细胞无显著促增殖作用。由此推测,FSH通过刺激颗粒细胞的增殖促使等级前卵泡进入等级发育。     

鹌鹑卵泡发育过程中颗粒细胞黄体生成素受体mRNA的表达

用Ｎorthern杂交的方法研究了鹌鹑排卵泡内颗粒细胞黄体生成素受体（ＬＨＲ）mＲＮＡ的表达。在预计排卵前２０h和３h分别取出最大的３个卵泡（Ｆ１、Ｆ３卵泡）以及小黄卵泡（ＳＹＦ）,剥离颗粒层提取出总ＲＮＡ,并经变性凝胶电泳后将ＲＮＡ转移到滤膜上。杂交所用的探针是用特异的引物经反转录一多聚栈链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出编码ＬＨＲcＤＮＡ的细胞外区（ＥＣ）和跨膜区（ＴＭ）cＤＮＡ。结果表明,颗粒细胞ＬＨＲmＲ     

分离培养兔子宫内膜细胞的鉴定及性激素对子宫内膜间质细胞形态的影响

为探讨子宫内膜细胞的形态学特点、分泌功能及性激素在子宫内膜细胞中的作用，采用不同的消化分离方法进行了孕早期家兔子宫内膜细胞的消化和分离培养试验。结果显示：子宫内膜主要包括两类细胞，基质细胞和上皮细胞，两类细胞分别在波形蛋白和细胞角蛋白免疫细胞化学染色中有阳性反应特点；在培养基中加入雌激素和／或孕酮刺激后，基质细胞形态发生变化，表现一定的蜕膜化现象。     

Subpopulations of Stromal Cells from Long-term Human Bone Marrow Cultures: Ontogeny of Progenitor Cells and Expression of Growth Hormone Receptors *

Long-term culture of bone marrow derived stromal colony forming cells (S-CFC) in matrix and nutrient defined agar medium resulted in stromal cell colonies that pass sequentially through three distinct morphological stages: firstly, aggregated loose syncytium of round to ovoid cells (stage I), a second developmental stage of large branching colonies in which the cells become enlarged, elongated with cytoplasmic projections forming a loosely anastomized network with adjacent cells (stage II), and finally cells become dissociated, loosing their long, thin cytoplasmic filaments and breaking their contacts with one another, but remain large and retain a bi-polar nature (stage III). Cells were also grown in liquid medium in a culture microenvironment closely resembling conditions of haemopoiesis in vitro. Using a panel of well defined monoclonal antibodies reactive against the rat, rabbit and human growth hormone receptors, this study found immunochemical evidence of the presence and localization of binding sites of growth hormone (GH) in the cell membrane and extra-nuclear Golgi area of long-term bone marrow derived human stromal cells in liquid and semi-solid nutrient agar mediums. GH-receptor immunoreactivity was present in small proliferating progenitor cells, myofibroblast-like cells, large reticular fibroblast cells, adipocytes and endothelial cells. Only MAb known to be reactive against human tissue resulted in strong immunoreactivity. The expression of GH-receptors not only on small proliferating, but also on the well differentiated cells, indicates a role for growth hormone on non-progenitor cells. GH-receptor immunoreactivity on differentiating and/or differentiated cells suggests that GH is also necessary for, or has a trophic function in differentiation. We propose that direct GH action is necessary not only for differentiation of progenitor cells as implied by the dual effector hypothesis, but also their subsequent clonal expansion, differentiation and maintenance.     

双氢睾酮对小鼠卵泡颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素表达的影响

【目的】探讨双氢睾酮(DHT)对小鼠颗粒细胞增殖与抗苗勒管激素(AMH)表达的影响。【方法】给3周龄的昆明小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG,10 IU/只)以获取颗粒细胞,颗粒细胞传代后48 h HE染色鉴定形态,绘制颗粒细胞的生长曲线,免疫荧光法鉴定促卵泡素受体(FSHR)的表达。当第2代颗粒细胞汇合度达到50%时,先用无血清的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h,然后在培养基中添加不同浓度的DHT (0、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5 mol/L),培养48 h后检测颗粒细胞增殖情况,实时荧光定量PCR法及ELISA法分别测定AMH基因及蛋白的表达。在颗粒细胞培养液中分别添加10^-6 mol/L Flutamide (雄激素受体(AR)特异性抑制剂)、10^-7 mol/L DHT、10^-7 mol/L DHT+10^-6 mol/L Flutamide、10^-5 mol/L DHT、10^-5mol/L DHT+10^-8 mol/L 11-ketodihydrotestosterone (AR特异性激动剂),分别记为F、D7、DF、D5、DK组,以不添加药物为对照组。培养48 h后,检测各组颗粒细胞增殖及AMH蛋白含量。【结果】体外培养的小鼠颗粒细胞呈梭形或铺路石状,生长曲线呈S形,细胞普遍表达FSHR;与0 mol/L DHT组相比,10^-8、10^-7 mol/L DHT组细胞增殖分别显著和极显著增加(P＜0.05;P＜0.01),10^-5 mol/L DHT组细胞增殖显著降低(P＜0.05);10^-7 mol/L DHT组AMH基因的相对表达量和AMH蛋白含量均极显著增加(P＜0.01)。与D7组相比,DF组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著降低(P＜0.01);与D5组相比,DK组颗粒细胞增殖和AMH蛋白含量均极显著升高(P＜0.01)。【结论】10^-7 mol/L DHT能够显著促进颗粒细胞增殖和AMH表达,而10^-5 mol/L显著降低了颗粒细胞增殖以及AMH表达,且AR介导了DHT调控颗粒细胞增殖和AMH表达。