阪崎肠杆菌单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

试验旨在制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,初步建立其ELISA检测方法。以灭活的阪崎肠杆菌全菌体为抗原免疫BALB/c小鼠,筛选血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞,并用间接ELISA法选取阳性杂交瘤细胞,扩大培养后测定单克隆抗体的效价,进行特异性及抗体间的配对,使用mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,并利用得到的抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。本试验得到3株具有良好特异性能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株5C10、2B6和Ab02,经两两配对,据阳性D_{450 nm}值及P/N值选择1：20000稀释的5C10作为包被抗体,1：40000稀释的Ab02作为酶标二抗,建立ELISA检测法,应用建立的方法与荧光定量PCR方法检测动物实验室保存的20份进出口送检奶粉样品,结果显示试验结果一致。本试验成功制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体并建立其ELISA检测法,为大批量快速检测阪崎杆菌奠定了基础。     

婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的研究进展

阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽胞杆菌,能引起新生儿脑膜炎,致死性小肠结肠炎和败血症等疾病.婴幼儿配方奶粉中若含有阪崎肠杆菌,则会引起一系列的临床症状.婴儿在前六个月应采用母乳喂养来减少致病菌的危害.婴儿配方奶粉不是一种无菌制品,为了减少婴儿感染的风险,应该对婴幼儿配方奶粉进行正规的卫生学检测.本文综述了阪崎肠杆菌的特性和一些检测方法.     

奶粉中阪崎肠杆菌在检测及控制方面的研究进展

阪崎肠杆菌是一种食源性的条件致病菌,婴幼儿若摄入了被该菌污染的奶粉,则可造成不可逆的致命伤害。本文主要综述了阪崎肠杆菌的生物化学特性以及其在检测和控制方面的研究进展。     

乳粉中阪崎肠杆菌耐热性的研究

长期以来,在食用食品前进行热处理一直被认为是降低食品中食源性致病菌风险的一个重要手段,但是目前国内对阪崎肠杆菌方面的研究还较少。文中主要从阪崎肠杆菌的培养、分离纯化、耐热性方面着手,重点研究阪崎肠杆菌的热耐受情况,为在食用前能有效地进行热处理以降低该菌的感染风险奠定良好的试验基础,并能够带来极大的社会与经济效益。     

乳制品生产过程中阪崎肠杆菌的控制研究

通过对乳制品企业常用的清洗杀菌剂对阪崎肠杆菌处理效果的试验分析,对其耐酸碱性和耐热性实施了验证,从而确定了乳制品加工过程中的清洗杀菌方法,为婴幼儿乳制品企业控制阪崎肠杆菌提供了有效的方法。     

食源性阪崎肠杆菌研究进展

阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）属肠杆菌科,是人和动物肠道内寄生的一种周生鞭毛、能运动、无芽孢的革兰氏阴性菌,一直以来被称为黄色阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）,于1980年以日本细菌学家Riichi Sakazakii的名字命名。由于阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和败血症,并且可能引起神经系统后遗症和死亡,近年来已经受到了研究者的广泛关注。目前,有关阪崎肠杆菌的污染来源还尚不清楚,有研究认为婴儿配方奶粉是新生儿阪崎肠杆菌感染的主要感染源。     

广州市售婴儿配方乳粉阪崎肠杆菌污染情况调查

目的:了解广州市售婴儿配方乳粉阪崎肠杆菌的污染情况.方法:对市售1 601个批次的婴儿配方乳粉进行阪崎肠杆菌检验.结果:广州市售婴儿配方乳粉共有5个国产品牌检出阪崎肠杆菌,阪崎肠杆菌总体不及格率为0.56％.结论:GB 10765-2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》的实施加强了对婴儿配方乳粉阪崎肠杆菌污染的检验监管力度,生产企业应高度重视婴幼儿配方食品的安全隐患问题.     

婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌检测方法试验研究

通过对阪崎肠杆菌的菌落形态、生理生化等生物学特性方面的试验,确定采用灭菌蒸馏水(DW)预增菌、肠杆菌增菌肉汤(EE)增菌、显色培养基琼脂[Xa-GlcA)分离、AP120E生理生化系统鉴定的方法,能准确判定出婴幼儿配方奶粉中是否含有阪崎肠杆菌.     

一例南方大口鲶烂尾病病原阪崎肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

从患烂尾病南方大口鲶的肝脏和心脏中分离到1株优势菌株DKN01,经API 20NE系统鉴定结果为阪崎肠杆菌。2次人工感染试验结果,DKN01对试验鱼的致死率在60%以上,是南方大口鲶烂尾病病原菌。该菌对复达欣、菌必治等8种药物高度敏感,对青霉素G、复方新诺明等7种药物不敏感。     

PCR荧光技术在阪崎肠杆菌检测中的应用

本文就婴幼儿配方奶粉中食源性致病菌阪崎肠杆菌的分类、来源、特性、致病性以及减少婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的措施进行了介绍和综述.着重介绍了阪崎肠杆菌国内外检测标准、技术和检测仪器;综述了国际通行的保证食品安全的荧光PCR食源菌检测标准、仪器和方法;论述了荧光PCR法检测阪崎肠杆菌的政策要求、技术标准、实验技术、检测步骤以及荧光PCR实验室建设要点.     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双抗夹心ELISA检测方法,本研究将BVDV 890病毒株(BVDV-2)浓缩并纯化后免疫BALB/c小鼠,经常规技术进行细胞融合并筛选得到一株稳定分泌IgG的杂交瘤细胞株,命名为3F9。以BVDV单克隆抗体(MAb)IgM为捕获抗体,生物素标记的3F9为检测抗体,初步建立BVDV特异的双抗体夹心ELISA检测方法(BAS-ELISA)。采用建立的BAS-ELISA方法检测35份临床病牛血清样品,检出阳性样本13份;与RT-PCR的符合率达到94.29%;表明本研究所建立的BAS-ELISA方法可用于BVDV感染的临床诊断,为BVDV的免疫学研究奠定了基础。     

光滑型布鲁氏菌LPS单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗布鲁氏菌单克隆抗体(MAb),本研究用灭活的布鲁氏菌疫苗M5-90株免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得杂交瘤细胞.以布氏杆菌疫苗株M5-90、S-19及小肠结肠炎耶尔森菌0:9的脂多糖(LPS)分别作为抗原包被酶标板,对杂交瘤细胞进行筛选,获得两株稳定分泌抗光滑型布氏杆菌LPS(S-LPS)MAb的细胞4G6和16C5.特异性分析表明,MAb 4G6除与耶尔森0:9全菌体有轻微的交叉反应外与其它革兰氏阴性菌无交叉,而16C5完全排除了与其他各菌的交叉反应.Ig亚型分析表明,所制备MAb的轻链亚类均为κ,4G6重链为IgM.16C5重链为IgG3.用Protein G亲和层析纯化MAb 16C5腹水并初步用于竞争ELISA方法,检测布氏杆菌抗体水平,结果表明了该实验方法的有效性.本研究制备的MAb 16C5具有高度的特异性和敏感性,排除了与其他革兰氏阴性菌的交叉反应,为建立一种诊断布鲁氏病的快速、有效、敏感的方法奠定了有力的基础.     

庆大霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

本研究采用碳二亚胺法将庆大霉素与载体蛋白偶联形成完全抗原,用基质辅助激光解吸/电离质谱进行了表征.以人工抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术获得了分泌抗庆大霉素单克隆抗体并能稳定传代的杂交瘤细胞株,建立了庆大霉素间接竞争ELISA检测方法,其线性检测范围为0.1～5 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为0.8 ng/mL,与其他化合物的交叉反应率小于0.01%.按药典剂量给患乳房炎奶牛肌肉注射庆大霉素注射液,不同时间段采集牛奶样品,按本研究建立的竞争ELISA方法测定了牛奶中的庆大霉素残留量.     

猪流行性腹泻病毒病S蛋白单抗制备及夹心ELISA检测PEDV方法的建立与应用

应用PCR扩增出PEDV毒株的纤突糖蛋白S基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出pGEX-4T-1-S表达载体。应用IPTG诱导表达重组S蛋白,并将重组蛋白以弗氏完全/不完全佐剂乳化后免疫小鼠,制备抗PEDV S蛋白的单克隆抗体,并以此建立了检测PEDV抗原的双抗体夹心ELISA方法,确定、优化了所建立的ELISA反应条件。以建立的双抗体夹心ELISA和RT-PCR方法对PEDV样品进行了比较检测,两者的符合率为100%。应用ELISA检测了吉林省疑似PED流行猪场的粪便样品,发现PEDV阳性检出率为68%。该研究为PED诊断及流行病学调查提供了一种特异、敏感、快速和易于在基层应用的技术方法及本病的防治提供了流行病学理论依据。     

伪狂犬病病毒gB蛋白单抗的制备及其夹心ELISA检测方法的建立

应用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒(PRV)gB基因,并将克隆的目的片段连接到表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-B。以表达纯化的gB重组蛋白为抗原,制备单克隆抗体和兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,同时对吉林省某地区猪群感染PRV的情况进行流行病学调查。结果显示,试验成功制备PRV gB蛋白单抗并建立其夹心ELISA检测方法。流行病学调查发现,PRV在吉林省某地区猪群的平均感染率为9.3%,且妊娠母猪阳性率高达11.7%,该结果为伪狂犬病的防治提供了理论依据。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异、敏感、简便与快速等优点,可用于PRV抗原的快速检测,为今后该病的诊断和流行病学调查研究提供技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。     

犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的犬瘟热病毒(CDV)检测方法,本实验应用杂交瘤细胞融合技术,建立了4株分泌抗CDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F7、H4和G12.相加ELISA试验显示4株MAb作用于CDV不同的抗原表位.选取相加指数较高的两株MAb G12和A2分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法,并对实验条件进行了优化.结果显示,该方法与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒等犬类病毒无交叉反应,敏感度为5 μg/mL,变异系数小于6％.利用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品,两种方法的符合率为100％.本实验建立的MAb夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点,适用于大批量临床样品检测.     

快速、特异检测李斯特菌单抗-夹心ELISA方法的建立及应用

本研究以高度特异的、针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌共同表位的单抗ＬＪ１０Ａ为捕捉抗原抗体和酶标抗体,建立了快速检测该菌的单抗夹心ＥＬＩＳＡ方法。该方法对单核细胞增生李斯特菌的最小检出量为５×１０５个菌／ｍｌ。人工模拟样品至少可检出５个菌／１０ｇ样品,并在４８小时内报告结果。在实际应用中,我们以该法检测了２４０份肉样和８５０份奶样,并平行以改良ＭｃＢｒｉｄｅ琼脂分离细菌相比较,证实该方法的敏感性和特异性分别达到１００％和９６．９％。     

抗猪IgG单克隆抗体的制备与应用

采用辛酸一硫酸铵盐析和SuperdexTM-200 凝胶层析分离纯化猪血清IgG,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得8株稳定分泌抗猪IgG 单克隆抗体的杂交瘤细胞.Ig 亚类分析表明,所制备单克隆抗体的轻链亚类均为K,重链除6H3为IgG2b外,其余7株均属于IgG1.Western blot分析显示,5株单克隆抗体识别猪IgG轻链,3株单克隆抗体识别猪IgG重链.以蛋白G亲和层析纯化单克隆抗体7H1腹水,用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,结果显示,HRP 标记抗猪IgG单克隆抗体对纯化猪IgG的工作浓度达1:12 800.将HRP标记鼠抗猪IgG单克隆抗体与HRP标记羊抗猪IgG多克隆抗体应用于猪血清圆环病毒抗体检测,二者符合率为95.12%,其ELISA和Westem blot的工作浓度为1:2 000和1:10000,表明HRP标记抗猪IgG单克隆抗体具有高度的敏感性.本研究制备的酶标抗猪IgG单克隆抗体为猪病的免疫诊断试剂研究和猪细胞生物学研究提供了一种基础工具.     

抗双氯青霉素单克隆抗体的制备与初步鉴定

采用碳化二亚胺法,将双氯青霉素(dicloxacillin)与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆,获得1株可稳定分泌McAb的杂交瘤细胞5D4-C9-C8;间接ELISA方法测定,其细胞上清抗体效价为1∶300,腹水效价为1∶3.5×105,为IgG1,与其结构类似物邻氯青霉素、苯唑青霉素的交叉反应率分别为17.6%和26.1%,与苄青霉素、羟氨苄青霉素和氨苄青霉素均无交叉反应性。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测双氯青霉素的ELISA试剂盒奠定了基础。