水稻白叶枯病菌gacA基因的克隆、测序及敲除研究

根据黄单胞菌gacA基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pvoryzae,Xoo）中克隆了gacA同源基因,命名为gacAxoo。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。蛋白质保守结构域搜索表明,GacAxoo属于LuxR家庭的一员,具有与其他GacA蛋白相似的结构。通过同源重组的方法,构建了gacAxoo的插入突变体,为下一步研究gacAxoo的功能奠定了良好的基础。     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的多重PCR检测体系开发

本研究设计水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌的专化性引物,建立了可同时检测这两种细菌的多重PCR检测体系。通过体系优化、特异性和灵敏度检查,结果表明：两对专化性引物X-b和X-t具有较高的特异性和灵敏度,对水稻细菌性条斑病菌液和水稻白叶枯病菌液的检测灵敏度分别为104 cfu/mL和105 cfu/mL;利用本研究建立的多重PCR体系,成功地从50种市售水稻种子中检测出1个水稻品种带有水稻细菌性条斑病菌,1个水稻品种水稻白叶枯病菌。本研究建立了多重PCR检测体系,为检疫部门控制这两种检疫性种传病害的入侵提供了有效检测技术和手段。     

水稻白叶枯病菌致病基因的研究进展

笔者综述了分子植物病理学科组对水稻白叶枯病菌致病基因的研究结果和进展，介绍了病菌致病基因研究中分子遗传学分析方法，报道了病菌毒性基因、无毒基因和受寄主诱导基因的特征和功能，阐述了致病基因对致病性、致病生化因子可能的调控关系，讨论了该领域的研究现状和前景。     

水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系的建立

水稻细茵性条斑病菌存在至少20个avrBs3/pthA家族成员,但其在水稻上的毒性或无毒性贡献并不清楚.本文依据avrBs3/pthA结构上的保守性,利用同源重组策略,借助自杀性载体pKMS1介导,对水稻条斑病菌中的avrBs3/pthA家族基因进行敲除.结果发现:同源交换可通过基因内和基因间重组实现avrBs3/pthA家族的基因敲除;PCR和Southern杂交结果显示,水稻条斑病菌中有5个avrB5s3/pthA家族基因被成功敲除,表明水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系构建成功.这为逐一评价avrBs3/pthA 家族基因的毒性或/和无毒性功能奠定了基础.     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌在不同培养基上的回收率测定

选用523培养基(523)、营养培养基(NA)和改良胁元培养基(WF—P)对水稻白叶枯病菌(B—3)和条斑病菌(A—1)的回收率测定结果表明,病原菌的回收率范围为12.3%～76.6%,其中A～1的平均回收率较高,达61.5%.B—3的平均回收率很低,仅为26.3%.同一菌株在不同培养基上的回收率亦存在明显差异,A—1在NA上的回收效果最佳,回收率达75.9%.在523和WF—P上较差;WF—P对B—3的回收率亦达46.1%,几乎是523和NA培养基的3倍.WF—P和NA可分别作为检测水稻白叶枯病菌和条斑病菌的基础培养基.     

水稻白叶枯病菌致病型的聚类分析

全国各病区筛选出的１９个代表菌株在我国，日本和ＩＲＲＩ的三套鉴别寄主上的反应，应用系统聚类法能有效地划分出水稻白叶枯病菌致病力极强，强，中强，中弱，弱和极弱６群。该法无需人为制定一个抗感标准，能额观反映病菌的致病类群。     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆｃ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆量个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。     

云南省水稻白叶枯病菌致病力差异的地理分布

使用12个分别持有不同抗病基因（Xa1,Xa2,Xa3,Xa4,Xa5,Xa7,Xa8,Xa10,Xa11,Xa13,Xa14和Xa21）的近等基因系水稻白叶枯病鉴别品种及3个对照品种（IR24，Toyonishiki和Sigadagabo），鉴别了从云南省收集的138个菌株。结果根据致病谱可以将这些菌株分成A－J共10组。A组菌株仅对Toyonishiki和Sigadagabo两个对照品种致病，J组菌株则能对9个鉴别品种和3个对照品种致病。对不同海拔采集的菌株进行致病力分析的结果表明，从大理、武定等较高海拔粳稻种植区采集的菌株致病力较弱，在鉴别品种上病斑的平均长度不到50mm；而元江、景洪、潞西等低海拔杂交稻种植区采集的菌株致病力较强，在鉴别品种上的病斑平均长度超过100mm。从高海拔稻区到低海拔稻区，病菌致病力有逐步增强的趋势。     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

Exchangeability of Two hrp Gene Fragments from Xanthomonas oryzae pv.oryzae and pv.oryzicola for Hypersensitive Response on Tobacco and Pathogenicity on Rice

hrp- mutants were produced from strain JXOIII of Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) and strain RS105 of X.o.pv.oryzicola (Xooc), respectively, by using diethyl sulfate (DES) as a mutagenic che-mical. All the hrp- mutants lost their pathogenicity on a susceptible host plant, rice (Shanyou63), and elicitation of the hypersensitive response (HR) on a nonhost plant, tobacco (NC89). Extracellular enzyme (amy-lase, pectate lyase, proteinase, cellulase and lipase) activities of all the hrp- mutants were similar to those of the corresponding wild type strains. The response of tobacco to cell-sonicated integrations of the wild type strains and the hrp- mutants demonstrated that there existed an HR eliciting substance which was heat-stable and sensitive to protease. No HR appeared on tobacco after infiltration of the lipopolysaccharide (LPS) of both the wild strains and hrp mutants into tobacco leaves. The ability of the Xooc hrp- mutants to induce HR on tobacco and cause streak disease on rice was restored by complementation with pUHRX245 from JXOIII genomic DNA library and by pUHRS138 from RS105 genomic DNA library, respectively. Subcloning of a 38.6-kb hrp fragment insert in pUHRX245 and a 39.3-kb insert in pUHRS138 revealed that a 3.3-kb SacⅠ fragment from pUHRX245 and a 4.5-kb BamHⅠ-KpnⅠ fragment from pUHRS138 were the minimal functional portions required for restoration of the ability of Xooc hrp- mutants to induce HR on tobacco and cause disease on rice. The disease symptom caused by the conjugant (M1005 plus 3.3-kb) on rice was similar to that caused by the wild type of Xooc. It suggests that the two fragments contain the same hrp gene(s) and are responsible reciprocally for HR induction on tobacco and pathogenicity on rice.     

水稻条斑病菌致病力分化研究

在历年测定的基础上,选择了从国内各地收集的28个水稻条斑病菌株,用针刺法接种在一套有鉴别力的水稻品种上,结果表明,不同菌株间的致病力差异显著,条斑病菌株与水稻品种间的互作反应大多表现弱互作模式,部分菌株与品种间存在强互作关系,根据供试菌株在鉴别品种IRBB5、IRBB7、IRBB3、IRBB21和JG30上致病力的差异,可区分成5种反应模式,分别为RRRRS、RRRSS、RRSSS、RSSRS、RSSSS.     

水稻条斑病细菌dsp基因的克隆

用硫酸二乙酯(DES)化学诱变水稻条斑病细菌RS105菌株，获得一株dsp基因突变体AM11。该突变体的菌落形态、颜色、胞外多糖产生能力以及胞外酶(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶)的活性与野生型菌株RS105无明显差异。将水稻条斑病细菌RS105基因库1200个克隆逐个导入dsp基因突变体AM11中，致病性测定结果表明，dsp基因阳性克隆pC101可以恢复AM11在水稻上的致病性。酶切分析显示，克隆pC101携44．92kb的dsp基因片段。亚克隆和功能互补结果显示，克隆pE46和pE47均具有恢复dsp突变体AM11致病性的能力，这表明决定水稻条斑病细菌dsp表型的基因位点至少有2个。     

水稻白叶枯病致病性基因研究进展

稻黄单胞菌水稻致病变种[Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)]可引起水稻白叶枯病,是水稻病害中最严重的病害之一,其与水稻互作是基因对基因的关系。Xoo基因组测序的完成极大推动了对Xoo基因功能的研究。为此,该文对近几年来Xoo致病性基因的鉴定情况进行统计,并就致病性基因的突变菌株对水稻接种情况和菌株自身变化进行了归纳,较为详细阐述了当前对Xoo无毒基因的鉴定研究状况,为水稻抗白叶枯病育种以及研究致病基因和致病机制提供理论基础。     

模块化质粒系统用于水稻条斑病菌基因表达的分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。近几年,在我国南方水稻产区,条斑病大面积发生,对水稻的安全生产构成严重威胁。为了准确地在Xoc中进行基因功能的分析,本研究设计出模块化的质粒系统,用于基因转录表达和蛋白表达的分析。为了验证该系统的可行性,选取hrpG、hrpX和hrpB1基因构建了相应的启动子载体和蛋白表达载体,将这些载体导入相应的hrp调控子基因trh、hrpG和hrpX的突变体中。GUS活性测定的结果显示,在XOM3培养基、寄主水稻组织和非寄主烟草组织中,启动子模块元件能够准确反映这3个hrp基因的调控表达模式。蛋白免疫杂交结果显示,HrpX蛋白表达水平反映的调控模式与hrpX启动子活性呈现的调控表达模式一致。水稻上致病性测定结果显示,有效表达的HrpG蛋白能够恢复hrpG突变体在寄主水稻上的致病性。这表明,这套模块化的载体系统能够有效应用于基因转录表达、蛋白表达和功能互补的分析。这将为Xoc-水稻互作研究提供有效的技术支持,加快Xoc毒性相关基因功能的研究。     

水稻白叶枯病菌tatB基因的克隆及功能分析

根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99的tatB基因序列设计引物,采用PCR方法从PXO99中克隆了tatB基因,命名为tatBXoo。通过同源重组的方法,构建了tatBXoo的插入突变株TBM,在含有X-gluc的抗性平板上筛选,并经Southern blot杂交验证确认。表型测定结果表明:与野生型相比,tatB突变株在水稻(寄主)上的致病性减弱,但在烟草(非寄主)上仍具有引起过敏反应的能力;tatB突变导致Xoo致病相关的重要表型如胞外多糖减少,游动性及趋化性减弱。但是,tatB突变不影响Xoo在基本培养基(MMX)中正常生长、胞外纤维素酶产生和生物膜形成。     

水稻白叶枯病菌hisF基因的克隆及功能初析

根据黄单胞菌hisF基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中克隆了hisF同源基因,命名为hisFXoo.NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,HisFXoo属于组氨酸生物合成蛋白家族的一员,具有与其他HisF蛋白相似的结构.序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的.同源性搜索比较显示,与水稻条斑病菌(Xoryzae pv.oryzicola,Xooc)的hisF(登录号:DQ372107)同源性高达98%.通过同源重组的方法,构建了hisFXoo的插入突变体,在NA+Amp平板上筛选后,并且经过PCR及Southern杂交验证插入正确.在MMX基本培养基中生长测定发现,hisF突变体生长能力明显下降,证明hisF基因与Xoo生长代谢相关.但是,该突变体仍具有致病性,并且毒力与野生型菌株没有明显差异.